，，，

(青島市市立醫(yī)院血液科，山東 青島 266071)

微小RNA(miRNA)為一類長(zhǎng)度約20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)調(diào)控[1]，其表達(dá)失調(diào)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[2-4]。多發(fā)性骨髓瘤(MM)發(fā)病率高居血液系統(tǒng)惡性疾病第2位。研究結(jié)果顯示，miRNA-19在MM細(xì)胞中高表達(dá)[5-6]。本文檢測(cè)了43例MM病人及20例正常對(duì)照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)中miRNA-19表達(dá)水平，并分析miRNA-19表達(dá)與MM預(yù)后和臨床分期關(guān)系，探討其在MM發(fā)生、發(fā)展中可能的作用及意義。

1 材料和方法

1.1 材料來源

MM病人骨髓標(biāo)本均取自我院血液科2006年5月—2011年3月住院的病人，符合張之南主編的《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》(1998年)中提出的MM診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)。其中男25例，女18例；年齡為38～78歲，中位年齡55歲。曾分別以MP、VAD、TD和沙利度胺等方案治療。其中初治25例，難治復(fù)發(fā)18例。3個(gè)療程化療后43例中31例有效，無變化和疾病進(jìn)展共12例。按照Durie-Salmon(D-S)分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期2例，Ⅱ期16例，Ⅲ期25例。β2-MG水平<4.0 mg/L者20例，≥4.0 mg/L者23例。對(duì)照組20例，男11例，女9例；年齡39～64歲，中位年齡51歲，均為骨髓常規(guī)正常門診病人。所有入選對(duì)象均無自身免疫性疾病及惡性腫瘤等。

1.2 試劑和儀器

Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Invitrogen公司)，Real-time PCR Master Mix(TOYOBO公司)，LightCyclerTM定量PCR儀(Roche公司)。

1.3 BMMNC的分離

取骨髓5 mL，EDTA抗凝，用生理鹽水稀釋 3～4倍，然后將其緩慢加至4 mL的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液中(相對(duì)密度1.077)，2 000 r/min離心 16 min。自界面層取得BMMNC，用生理鹽水洗滌3次，以2×108/L的密度接種于含體積分?jǐn)?shù)0.15的新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2和全濕條件下培養(yǎng)。

1.4 總RNA的提取和miRNA-19表達(dá)檢測(cè)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，為增加miRNA得率，將異丙醇沉淀步驟改為-20 ℃沉淀2 h以上。定量檢測(cè)RNA濃度(A260/A280比值>1.8方可用于檢測(cè))。加poly(A)尾后，應(yīng)用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以(Oligo)dT為引物，反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，70 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。以此制備的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參照，在Roche定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，所有樣品均做3個(gè)復(fù)孔，總反應(yīng)體系為20 μL。設(shè)定反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s后，95 ℃變性5 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s。按照比較閾值法[7]，讀取Ct值，用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因miRNA-19的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-19在MM中的表達(dá)

MM組miRNA-19表達(dá)水平為6.80±0.87，顯著高于對(duì)照組，其中復(fù)發(fā)難治組miRNA-19表達(dá)水平為8.49±0.74，初治組為4.35±0.91，兩者比較差異有顯著性(t=5.82，P<0.05)。

MM病人化療前miRNA-19表達(dá)水平為6.80±0.87，化療后miRNA-19為3.43±1.57，化療后較化療前明顯降低(t=2.61，P<0.05)，其中化療有效組化療前miRNA-19表達(dá)水平為4.97±0.49，化療后為1.99±0.61，化療后較化療前明顯降低，差異有顯著意義(t=3.83，P<0.05)；無效進(jìn)展組化療前mi-RNA-19表達(dá)水平為8.06±0.24，與化療后mi-RNA-19表達(dá)水平(6.83±0.57)相比無明顯改變。無效進(jìn)展組化療前miRNA-19表達(dá)水平為8.06±0.24，化療有效組為4.97±0.49，兩組比較差異有顯著性(t=5.15，P<0.05)。

2.2 miRNA-19表達(dá)水平與β2-MG和D-S分期的相關(guān)性

Ⅲ期MM病人miRNA-19表達(dá)水平為7.89±1.07，明顯高于Ⅱ期MM病人miRNA-19表達(dá)水平(4.46±0.43)，差異有顯著性(t=3.54，P<0.05)。β2-MG血漿水平≥4.0 mg/L MM的病人miRNA-19的表達(dá)水平為7.67±1.29，明顯高于β2-MG<4.0 mg/L組miRNA-19表達(dá)水平(4.35±0.95)，差異有顯著性(t=4.09，P<0.05)。

3 討 論

MM是一種源發(fā)于免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，已成為第二常見的惡性血液病，由于異常漿細(xì)胞和單克隆免疫球蛋白過度增生，導(dǎo)致嚴(yán)重的體液免疫缺陷和骨骼破壞，MM病死率高[8-9]。目前MM發(fā)病機(jī)制不清，治療效果個(gè)體差異性大，已有的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)不能很好地體現(xiàn)病情的復(fù)雜性，對(duì)其發(fā)病機(jī)制和預(yù)后影響因素的深入研究是有效解決臨床治療難題的關(guān)鍵。

目前普遍認(rèn)為miRNA與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，miRNA-19在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的癌基因作用，其過度表達(dá)與MM、白血病、淋巴瘤以及乳癌等非血液系統(tǒng)實(shí)體腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和疾病預(yù)后密切相關(guān)[5-6,10-11]。PICHIORRI等[6]研究結(jié)果顯示，細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1(SOCS-1)是miRNA-19靶基因，過表達(dá)的miRNA-19能抑制SOCS-1表達(dá)，SOCS-1是IL-6信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制因子，miRNA-19高表達(dá)間接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡受抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。OLIVE等[12]研究顯示，在腫瘤細(xì)胞中miRNA-19通過活化Akt-mTOR信號(hào)途徑，抑制Pten，促進(jìn)c-myc誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖。LIANG等[13]研究顯示，miRNA-19與腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)，而抑制miRNA-19表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥，機(jī)制可能與miRNA-19靶向作用Pten有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，MM病人miRNA-19過表達(dá)，其中復(fù)發(fā)難治組miRNA-19表達(dá)明顯高于初治組，化療后miRNA-19表達(dá)降低，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符，提示miRNA-19在MM中發(fā)揮著重要的致癌基因作用。本研究還顯示，化療后miRNA-19表達(dá)降低以化療有效組最為明顯，無效進(jìn)展組miRNA-19表達(dá)化療前后無明顯改變，而且無效進(jìn)展組病人化療前miRNA-19表達(dá)顯著高于同期化療有效組，提示miRNA-19高水平表達(dá)可能為MM病人的不良預(yù)后指標(biāo)，與MM預(yù)后有密切關(guān)系。本研究還通過比較β2-MG和D-S分期不同組間MM病人miRNA-19表達(dá)水平差異，進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-19和MM腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和疾病預(yù)后有密切關(guān)系，可作為MM預(yù)后不良指標(biāo)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，miRNA-19通過對(duì)靶基因的調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，可作為MM預(yù)后不良指標(biāo)之一。利用反義寡核苷酸抑制miRNA-19表達(dá)將是MM治療的一個(gè)新研究方向。相信隨著基因技術(shù)的成功發(fā)展，miRNA-19將會(huì)成為MM診斷標(biāo)志物和治療耐藥的新靶點(diǎn)。

[1] TURNER M L, SCHNORFEIL F M, BROCKER T. Micro-RNAs regulate dendritic cell differentiation and function[J]. J Immunol, 2011,187(8):3911.

[2] SAYED D, ABDELLATIF M. MicroRNAs in development and disease[J]. Physiol Rev, 2011,91(3):827-887.

[3] ESQUELA-KERSCHER A, SLACK F J. Oncomirs-micro-RNAs with a role in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(4):259-269.

[4] ZHANG W, DAHLBERG J E, TAM W. Micro-RNAs in tumorigenesis:A primer[J]. Am J Pathol, 2007,171(3):728-738.

[5] TODOERTI K, BARBUI V, PEDRINI O, et al. Pleiotropic anti-myeloma activity of ITF2357: inhibition of interleukin-6 receptor signaling and repression of miRNA-19a and miRNA-19b[J]. Haematologica, 2010,95(2):260-269.

[6] PICHIORRI F, SUH S S, LADETTO M, et al. MicroRNAs regulate critical genes associated with multiple myeloma pathogenesis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 200,105(35):12885.

[7] SCHMITTGEN T D, LIVAK K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C (T) method[J]. Nat Protoc, 2008,3(6):1101-1108.

[8] 崔中光,吳春梅,汪洪毅,等. 多發(fā)性骨髓瘤病人sICAM-1檢測(cè)及臨床意義[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009,45(6):571-572.

[9] 石晶,崔中光,汪洪毅. 多發(fā)性骨髓瘤病人血清游離輕鏈檢測(cè)的臨床意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2011,26(3):192-194.

[10] MAVRAKIS K J, WOLFE A L, ORICCHIO E, et al. Genome-wide RNA-mediated interference screen identifies miRNA-19 targets in Notch-induced T-cell acute lymphoblastic leukaemia[J]. Nat Cell Biol, 2010,12(4):372-379.

[11] ZHANG X, YU H, LOU J R, et al. MicroRNA-19 (miRNA-19) regulates tissue factor expression in breast cancer cells[J]. J Biol Chem, 2011,286(2):1429-1435.

[12] OLIVE V, BENNETT M J, WALKER J C, et al. miRNA-19 is a key oncogenic component of miRNA-17-92[J]. Genes Dev, 2009,23(24):2839-2849.

[13] LIANG Z, LI Y, HUANG K, et al. Regulation if miRNA-19 to breast cancer chemoresistance through targeting PTEN[J]. Pharm Res, 2011,28(12):3091-3100.