趙 新， 王 永， 蘭青闊， 陳 銳， 朱 珠， 余景會， 李歐靜， 郭永澤

（天津市農(nóng)業(yè)科學院 中心實驗室，天津 300381）

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界每年有數(shù)以億計的食源性疾病患者中，70%病源是各種致病性微生物。因而，建立一種準確快速的檢測致病菌的方法一直是研究的熱點[1-2]。國外針對致病微生物的快速檢測，目前主要采用免疫學方法和顯色培養(yǎng)基方法以及微生物自動鑒定系統(tǒng)[3-5]。上述方法的優(yōu)點就是節(jié)省一定的鑒定時間，但缺點也非常明顯，免疫學方法的缺點是操作技術(shù)性要求高，假陰性高，普及困難；顯色培養(yǎng)基的缺點是不穩(wěn)定，貯存時間短，受外界因素影響大；對于微生物自動鑒定系統(tǒng)，我國還未能生產(chǎn)完全自動化的細菌鑒定儀器設備，而且配套試劑也完全依賴進口。

隨著生命科學的飛速發(fā)展，各種分子生物學實驗技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并且以PCR技術(shù)為基礎的分子生物學檢驗技術(shù)近年來已經(jīng)廣泛應用于微生物檢測領(lǐng)域，但是這些技術(shù)僅能提供陽性擴增產(chǎn)物的片段大小信息，且無法顯示特異性的基因序列，假陰性和假陽性無法避免，因此不足以提供確證結(jié)論。那么，焦磷酸測序 （Pyrosequencing）技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，從而能夠真正達到快速、準確的鑒定病原微生物的目的，且操作極為簡便[6]。

作者旨在利用焦磷酸測序技術(shù)建立同步檢測和鑒定沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌等主要食源性致病菌的快速、簡便、靈敏度高的方法，以期克服傳統(tǒng)及其他快速致病微生物檢測方法的諸多缺點，得到與國標方法一致的檢測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株

1）目標菌標準菌株:乙型副傷寒沙門氏菌CMCC （B）50094、 甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50433、鼠傷寒沙門氏菌 CMCC（B）50013；痢疾志賀氏菌 CMCC （B）51592、 福氏志賀氏菌 CMCC（B）51571、鮑氏志賀氏菌ATCC 9207；金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003；單增李斯特氏菌 CMCC（B）54002共8株常見的危害人和動物的沙門氏菌:作者所在實驗室購買標準菌株。菌株復蘇后接種于相應的增菌培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。

2）非目標菌標準菌株:蠟樣芽孢桿菌CMCC（B）63301，枯草芽孢桿菌 CMCC（B）63501，大腸埃希氏菌 CMCC（B）44102，銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104，馬紅球菌ATCC 6939:作者所在實驗室購買標準菌株。菌株復蘇后接種于相應的增菌培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 特異性擴增引物和測序引物:上海生工合成；GoTaqRMaster Mix溶液:購自Promega 公 司 ；Sepharose Bead、binding buffer、Annealing Buffer、底物、酶和 A、C、G、T 四種堿基:購自Biotage公司；定量遺傳分析儀:購自基因有限公司；PCR擴增儀:ABI Veriti及ABi 2720；凝膠電泳設備:BIO-RAD Power200；凝膠成像系統(tǒng):SYNGENE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 通過基因庫數(shù)據(jù)檢索網(wǎng)站 NCBI、VFDB、KEGG和 ClustalW 程序分別對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌毒力靶基因序列進行同源性分析，尋找各自適合的特異性序列[7-8]；再應用焦磷酸測序儀配套專業(yè)軟件設計適合沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的焦磷酸測序特異性擴增和測序引物。

1.2.2 細菌DNA的提取 取選擇性增菌后菌液100 μL，100 ℃煮菌 10 min， 立即-20 ℃冰浴 10 min，微型離心機離心2～3 min，上清液即為細菌DNA模板，備用。

1.2.3 PCR反應體系及擴增程序 擴增反應的總體積為 50 μL，其各種成分分別為:2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用滅菌去離子水補齊至50 μL；反應程序:94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 測序單鏈的制備將 3 μL鏈親和素包被的磁珠和47 μL的binding buffer混勻，然后加入到50 μL的PCR產(chǎn)物中，1 300～1 400 r/min室溫振蕩混勻10～15 min；在PSQ Low反應板中預先加入40 μL含有 0.3 μmol/L 測序引物的 Annealing Buffer；在Vacuum prep workstation中進行單鏈制備，備用。

1.2.5 測序反應體系測序 反應的總體積約為150 μL， 其 中 各 種 成 分 分 別 為:PCR產(chǎn) 物 50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer 47 μL （10 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1 g/dL Tween20，pH 7.6），10 μmol/L 測序引物 1.2 μL，Annealing Buffer 38.8 μL （20 mmol/L Tris-AC，2 mmol/L MgAC2，pH 7.6），再根據(jù)軟件提示在試劑艙相對應位置加入所需的底物，酶和A、C、G、T。

1.2.6 測序反應程序 沙門氏菌CTTGACCCGGA AGCCTCCGC；單增李斯特氏菌ATTCACAACT TGG ATATCTG；金黃色葡萄球菌TTGATGATTGCCTA TCCCAAA；志賀氏菌AAACGGTCCAGTCGAAGTTC。

1.2.7 引物特異性試驗 以目標菌的特異性引物和非目標菌的DNA模板構(gòu)建PCR反應體系，進行PCR擴增及焦磷酸測序，以鑒定引物設計的特異性。

1.2.8 樣品模板惟一性試驗 以目標菌的特異性引物和含有目標菌同時也含有其他菌的DNA模板構(gòu)建PCR反應體系，進行PCR擴增及焦磷酸測定，以證明對樣品模板的質(zhì)量要求。

1.2.9 添加靈敏度對比試驗 將4種致病菌菌液分別進行 10 倍梯度稀釋， 篩選出 105、104、103、102、10、1、0 CFU/mL的菌懸液，各取1 mL添加于24 mL無菌牛奶樣本中備用。將上述一系列25 mL牛奶樣本按照傳統(tǒng)國標方法增菌，并進行后期生化鑒定[9-12]；同時將第一步的增菌液各取100 μL，用煮菌法提取模板DNA，用于PCR擴增而后進行焦磷酸測序。

1.2.10 方法驗證 為了進一步驗證本研究建立的食源性致病菌焦磷酸測序技術(shù)在實際檢測中的可用性，應用本研究檢測方法對包括雞肉及制品、牛肉及制品、豬肉及制品、生鮮牛乳、蔬菜等共計284份日常實際樣品進行了檢測，并與國家標準方法的檢驗結(jié)果進行比較。沙門氏菌檢驗采用國家標準方法GB 4789.4-2010，單核細胞增生李斯特氏菌檢驗采用國家標準方法GB 4789.30-2010，金黃色葡萄球菌檢驗采用國家標準方法GB 4789.10-2010，志賀氏菌檢驗采用國家標準方法GB/T 4789.5-2003。

2 結(jié)果與討論

2.1 引物設計結(jié)果

通過基因庫數(shù)據(jù)檢索網(wǎng)站NCBI BLAST，ClustalW程序和焦磷酸測序儀配套專業(yè)軟件分別對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進行焦磷酸測序特異性擴增引物和測序引物的設計，引物設計情況見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences in this study

2.2 PCR反應擴增結(jié)果

擴增反應的總體積為50 μL，其各種成分分別為:2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，模板DNA 2 μL，用滅菌去離子水補齊至50 μL；反應程序:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μL用2 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳，均能得到擴增片段大小的條帶，且空白對照均正常，結(jié)果見圖1。

圖1 4種食源性致病菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜Fig.1 PCR amplification result of four-kinds of foodborne pathogenic bacteria

2.3 焦磷酸測序結(jié)果

根據(jù)對4種食源性致病菌特異性序列的同源性比對，設計擴增引物和測序引物，通過基因庫數(shù)據(jù)檢索網(wǎng)站得到的4種食源性致病菌的已知待測序序列分別為:沙門氏菌CTTGACCCGG AAGCCTC CGC；金黃色葡萄球菌TTGATGATTG CCTATCCCA AA；志賀氏菌 AAACGGTCCA GTCGAAGTTC；單核細胞增生李斯特菌ATTCACAACT TGGATATCTG，經(jīng)本實驗方法焦磷酸測序后結(jié)果與已知待測序列吻合，結(jié)果見圖 2～5。

圖2 沙門氏菌擴增產(chǎn)物測序結(jié)果圖Fig.2 Result of Salmonellla spp pyrosequencing

圖3 金黃色葡萄球菌擴增產(chǎn)物測序結(jié)果圖Fig.3 Result of Staphylococcus aureus pyrosequencing

圖4 志賀氏菌擴增產(chǎn)物測序結(jié)果圖Fig.4 Result of Shigella cereus pyrosequencing

圖5 單核細胞增生李斯特菌擴增產(chǎn)物測序結(jié)果圖Fig.5 Result of Listeria monocytogenes pyrosequencing

2.4 引物特異性試驗結(jié)果

以4種食源性致病菌的特異性引物分別與沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌的DNA模板以及其他非目標菌的混合DNA模板進行PCR擴增及焦磷酸測序，只有與特異性引物相吻合的DNA模板得到預期擴增片段大小及相應峰型，其余均未得到特異性條帶及和已知序列吻合的峰型，由此鑒定了引物設計的特異性，結(jié)果見表2。

表2 引物特異性試驗Table 2 Result of specific primers

2.5 樣品模板惟一性試驗

以沙門氏菌的特異性引物和含有沙門氏菌同時也含有其他菌的DNA模板構(gòu)建PCR反應體系；以金黃色葡萄球菌的特異性引物和含有金黃色葡萄球菌同時也含有其他菌的DNA模板構(gòu)建PCR反應體系（其他兩種菌同理），進行PCR擴增及焦磷酸測定，均可得到相應目標菌的特異性條帶及吻合峰型，由此證明只要樣品模板中含有目標菌，就能擴增出特異性條帶及吻合峰型，無需要求樣品進行目標菌的純培養(yǎng)，只要對樣品進行一步目標菌選擇性增菌，即可進行PCR擴增和焦磷酸測序，即使含有其他菌也不會影響試驗結(jié)果，見表3。

2.6 添加靈敏度對比實驗結(jié)果

4種食源性致病菌的傳統(tǒng)國標方法鑒定結(jié)果為105、104、103、102、10 CFU/mL 的 添 加 樣 品 均 檢 出 ，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加樣品未檢出；焦磷酸測序 方 法 測 序 結(jié) 果 與 為 105、104、103、102、10 CFU/mL的添加樣品均檢出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加樣品未檢出。由此可見，焦磷酸測序方法基于傳統(tǒng)國標法的一步增菌，完全可達到相同的靈敏度，但省去了后期繁瑣而費時的生化鑒定步驟，見圖6～9。

表3 樣品模板唯一性試驗Table 3 Result of uniqueness of sample template

圖6 沙門氏菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜Fig.6 PCR amplification result ofspecific primers in Salmonellla spp

圖7 單核細胞增生李斯特菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜Fig.7 PCR amplification result of specific primers in Listeria monocytogenes

圖8 金黃色葡萄球菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜Fig.8 PCR amplification result of specific primers in Staphylococcus aureus

圖9 志賀氏菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜Fig.9 PCR amplification result of specific primers in Shigella cereus

2.7 方法驗證結(jié)果

在所檢測的284份日常實際檢測樣品中，沙門氏菌檢驗實際抽取樣品127份，單核增生李斯特氏菌檢驗實際抽取樣品87份，金黃色葡萄球菌檢驗實際抽取樣品40份，志賀氏菌檢驗實際抽取樣品30份，檢測結(jié)果見表4。本研究建立的焦磷酸方法檢出的4種食源性致病菌的陽性率與傳統(tǒng)國標方法檢測結(jié)果完全一致。

3 結(jié)語

近年來，人們對于食源性致病菌快速檢測技術(shù)的研究已越來越深入，焦磷酸測序技術(shù)目前在國內(nèi)、外領(lǐng)域還處于比較前沿和新型的技術(shù)手段時期，將該技術(shù)應用于食源性致病菌快速檢測選擇合適的毒力靶基因并設計出特異性擴增引物和測序引物對焦磷酸測序技術(shù)至關(guān)重要。通過4種食源性致病菌特異性保守序列同源性分析，結(jié)合焦磷酸實際應用要求，找到適合的特異性擴增片段區(qū)域100～200 bp，以及在此區(qū)域內(nèi)4種食源性致病菌符合測序要求20 bp左右的變異區(qū)域或位點，利用專業(yè)軟件得到特異性擴增引物和測序引物，并在擴增引物的上游或下游引物標記鏈親和素包被的磁珠用于后期單鏈制備。

表4 焦磷酸測序方法驗證Table 4 Method validation for Pyrosequencing method

單鏈制備在焦磷酸測序過程中也是關(guān)鍵步驟之一，且通過實際試驗發(fā)現(xiàn)鏈親和素包被的磁珠的充分吸附對試驗結(jié)果影響明顯，所以選用平底96孔板作為磁珠孵育及抓取底板，方法改進后效果明顯。

作者建立的焦磷酸測序方法是將微生物檢測基于分子水平的研究，且實現(xiàn)了在基因水平上對致病微生物進行最本質(zhì)的序列分析及鑒定[13-14]。該方法通過對284份日常實際檢測樣品的驗證不僅與傳統(tǒng)國標方法檢測結(jié)果一致，而且還具備準確、快速、操作簡便和實時檢測等優(yōu)點，可以很好的杜絕假陽性及假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，為食源性致病菌的快速鑒定開辟了廣闊的前景[15-17]。

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