■許凈凈 李 佳 李卓偉 朱寶成 袁洪水

（河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定 071000）

棉籽餅是棉籽在榨油過程中所剩余的副產(chǎn)品，棉籽餅營養(yǎng)豐富，尤其是粗蛋白和各種氨基酸的含量很高，因此廣泛應用于畜禽飼料中[1-2]。但是棉籽餅中含有的游離棉酚具有毒性，對動物的采食量、生長發(fā)育以及內(nèi)臟器官，尤其是對動物的生殖系統(tǒng)有嚴重的損害[3-7]。因此，棉籽餅應用于畜禽飼料前應對其進行脫毒處理。目前，棉籽餅粕的主要脫毒方法有物理法(有機溶劑萃取熱處理、機械壓榨)、化學法(硫酸亞鐵、氫氧化鈣)以及微生物發(fā)酵法[8]。傳統(tǒng)的物理脫毒法脫毒效果不理想，對營養(yǎng)成分的損失大；化學脫毒法的工藝復雜、周期長，而且存在化學試劑殘留的問題[9]。微生物發(fā)酵法不僅可以使棉籽餅中游離棉酚的含量大大降低，還可以提高棉籽餅中粗蛋白和營養(yǎng)成分的含量，因此微生物發(fā)酵法是較有前途的發(fā)酵方法。

本實驗室篩選得到了一株棉酚降解活性較高的菌株，命名為菌株F-1并鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。本研究為了確定F-1菌株的安全性，采用F-1菌株的發(fā)酵液進行了小白鼠毒性試驗。為了進一步提高棉酚降解菌發(fā)酵液的菌體濃度，對F-1菌株的產(chǎn)芽孢條件進行了優(yōu)化，通過單因素試驗和正交試驗確定了F-1菌株的最佳發(fā)酵條件，為菌株F-1應用于生產(chǎn)制成棉籽餅脫毒菌劑奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

F-1菌株由河北農(nóng)業(yè)大學制藥工程系提供。

1.1.2 試驗動物

昆明系小白鼠購自河北農(nóng)業(yè)大學動科院，共計30只，分為兩組，每組15只。

1.1.3 培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基[10]。

基礎液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、NaH2PO4·H2O 0.03%、K2HPO40.05%、MnSO4·H2O 0.02%，pH值7.2～7.4。

1.2 試驗方法

1.2.1 小白鼠毒性試驗

將F-1菌株接種于NB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，計數(shù)。將小鼠隨機分成對照組和試驗組兩組，每組15只。試驗組小鼠灌胃F-1菌株的發(fā)酵液，對照組小鼠灌胃同樣體積的NB培養(yǎng)基。灌胃小鼠的細菌量為6×107個芽孢/(只·d)。試驗前5 d進行正常飼喂，使小鼠適應新環(huán)境。試驗期為30 d，每天觀察兩次，保證充足的食物和飲水。試驗結(jié)束時，將小白鼠頸椎脫臼致死，解剖，觀察肝臟和腎臟的縱切剖面及色澤，記錄結(jié)果。

1.2.2 F-1菌株產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化

1.2.2.1 芽孢產(chǎn)率測定方法

活菌總數(shù)：采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)。

芽孢總數(shù)：80℃水浴加熱15 min后，采用平板菌落計數(shù)法檢測芽孢的總數(shù)。芽孢產(chǎn)率即芽孢總數(shù)與活菌總數(shù)的比值。

1.2.2.2 菌株最適種齡

將F-1菌株的斜面接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從零時開始取樣，以后每隔2 h取一次直至培養(yǎng)到24 h為止，以未接菌的培養(yǎng)基做空白調(diào)零，用分光光度計測相對菌體濃度（600 nm下的光吸收值）。以生長時間為橫軸、以相對菌體濃度為縱軸繪制曲線。

1.2.2.3 單因子試驗

1.2.2.3.1 不同碳源對芽孢產(chǎn)率的影響

碳源分別取0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、麥麩、淀粉與玉米粉代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖，基礎培養(yǎng)基中其他成分不變。搖床培養(yǎng)，24 h后取樣觀察并測定芽孢生成情況。

1.2.2.3.2 不同氮源對芽孢產(chǎn)率的影響

采用以上單因子試驗得到的最優(yōu)碳源為碳源，氮源分別采用1%蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、黃豆餅粉、酪蛋白、尿素、(NH4)2SO4代替基礎培養(yǎng)基中1%的蛋白胨，其它成分不變。搖床培養(yǎng)，24 h后取樣觀察并測定芽孢生成情況。

1.2.2.3.3 不同無機鹽對芽孢產(chǎn)率的影響

采用以上單因子試驗得到的最優(yōu)碳源、最優(yōu)氮源代替基礎培養(yǎng)基中的碳源和氮源，無機鹽分別采用 FeCl3、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2·2H2O、ZnCl2，其它成分不變。搖床培養(yǎng)，24 h后取樣觀察并測定芽孢生成情況。

1.2.2.4 正交試驗

采用4因素3水平正交試驗，使用單因子試驗所測定出的最適碳源、氮源、無機鹽配制不同濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基，進行發(fā)酵培養(yǎng)，具體因素水平設計如表1所示，取發(fā)酵液測定其中芽孢產(chǎn)率。

表1 最適培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗的因素水平設計

采用4因素4水平正交試驗，使用正交試驗中測定出的最適發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同發(fā)酵條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，具體發(fā)酵條件優(yōu)化試驗的因素水平設計如表2所示，取發(fā)酵液測定其中芽孢產(chǎn)率。

表2 最適培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗的因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 小白鼠毒性試驗

經(jīng)灌胃發(fā)酵液的試驗組小白鼠，采食量和飲水正常，生長發(fā)育良好，與對照組相比小白鼠無明顯差別。試驗組小白鼠解剖后，未發(fā)現(xiàn)臟器的腫大和任何病變。通過對肝臟和腎臟的縱切剖面和色澤的觀察，試驗組小白鼠的肝臟與腎臟與對照組一致，證明菌株F-1較安全。

2.2 產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 菌株最適種齡的確定（見表3、圖1）

表3 菌株F-1生長曲線

圖1 菌株F-1生長曲線

本試驗通過測定OD600的吸光度值來反映發(fā)酵液的菌體濃度。對數(shù)生長末期的菌體濃度達到最大，是菌株最適的接種時間。由圖1分析得出，16 h時菌體快速生長達到對數(shù)生長末期，之后OD值變化不大，故確定16 h是菌株的最適種齡。

2.2.2 不同碳源對芽孢產(chǎn)率的影響（見表4）

表4 不同碳源對芽孢產(chǎn)率的影響

碳源分別采用0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、麥麩、淀粉與玉米粉代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖，其他成分不變配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃、滅菌15 min。將培養(yǎng)好的液體菌種以6%的接種量接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中。于200 r/min、37℃搖床培養(yǎng)，取發(fā)酵液測定其中芽孢產(chǎn)率。

從表4可以看出，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中菌體芽孢產(chǎn)率最高，達到85.8%，所以最佳碳源為蔗糖。

2.2.3 不同氮源對芽孢產(chǎn)率的影響（見表5）

表5 不同氮源對芽孢產(chǎn)率的影響

碳源為蔗糖，氮源分別采用1%蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、黃豆餅粉、酪蛋白、尿素、(NH4)2SO4代替基礎培養(yǎng)基中1%的蛋白胨，其它成分不變，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。121℃、滅菌15 min，將培養(yǎng)好的液體菌種以6%的接種量接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于200 r/min、37℃搖床培養(yǎng)，取發(fā)酵液測定其中芽孢產(chǎn)率。

從表5可以看出，以牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基中芽孢產(chǎn)率最高，達到85.1%，所以最佳氮源為牛肉浸膏。

2.2.4 不同無機鹽對芽孢產(chǎn)率的影響（見表6）

表6 不同無機鹽對芽孢產(chǎn)率的影響

以蔗糖為碳源，牛肉浸膏為氮源，分別采用FeCl3、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2·2H2O、ZnCl2為無機鹽，基礎培養(yǎng)基中其他成分不變，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。121℃、滅菌15 min，將培養(yǎng)好的液體菌種以6%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。于200 r/min、37℃搖床培養(yǎng)，取發(fā)酵液測定其中芽孢產(chǎn)率。

從表6可以看出，以FeCl3為無機鹽的培養(yǎng)基芽孢產(chǎn)率較高，為81.9%，以MgSO4·7H2O為無機鹽的培養(yǎng)基芽孢產(chǎn)率最高，為86.2%，而且經(jīng)試驗驗證，無機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O對芽孢產(chǎn)量的影響都較大，所以選擇無機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O在正交試驗中進行優(yōu)化。

2.2.5 正交試驗結(jié)果

2.2.5.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化的正交試驗(見表7)

以蔗糖為碳源，牛肉浸膏為氮源，F(xiàn)eCl3為無機鹽Ⅰ以及MgSO4·7H2O為無機鹽Ⅱ，按表7中的正交試驗表配制成不同的培養(yǎng)基。121℃、滅菌15 min，發(fā)酵后取發(fā)酵液測定芽孢產(chǎn)率。

表7 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

由表7可知，RA＞RD＞RC＞RB，即碳源的R值最大，表明碳源對芽孢產(chǎn)率的生成影響最大，其次為無機鹽Ⅱ、無機鹽Ⅰ和氮源。由正交試驗分析可知，芽孢產(chǎn)率最高的組合為A3B3C3D2，即蔗糖0.5%、牛肉浸膏5%、FeCl30.1%、MgSO4·7H2O 0.05%。由于該組合沒在正交表內(nèi)，設計該組合與正交表中芽孢產(chǎn)率最高的項目7的驗證試驗。試驗結(jié)果得出該組合的芽孢產(chǎn)率為92.3%，項目7的芽孢產(chǎn)率為90.6%。該驗證試驗表明，A3B3C3D2組合的芽孢產(chǎn)率高于項目7的芽孢產(chǎn)率，即該組合為培養(yǎng)基的最優(yōu)組合。因此，確定最適培養(yǎng)基為：蔗糖0.5%、牛肉浸膏5%、FeCl30.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、NaH2PO4·H2O 0.03%、K2HPO40.05%、MnSO4·H2O 0.02%。

2.2.5.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗（見表8）

表8 培養(yǎng)條件的正交試驗結(jié)果

以pH值、裝液量、發(fā)酵時間、接種量為優(yōu)化對象，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌15 min，進行發(fā)酵，取發(fā)酵液測定芽孢產(chǎn)率。

由表 8 可知，RC＞RB＞RD＞RA，即發(fā)酵時間的 R值最大，表明發(fā)酵時間對芽孢產(chǎn)率的影響最大，其次為裝液量、接種量及pH值。由正交分析結(jié)果可知，芽孢產(chǎn)率最高的組合為A2B1C2D1，即pH值7.2，裝液量50 ml/250 ml，發(fā)酵時間48 h，接種量4%。由于該組合沒出現(xiàn)在正交試驗表中，設計該組合與正交表中芽孢產(chǎn)率最高的項目10的驗證試驗。結(jié)果該組合的芽孢產(chǎn)率為96.5%，項目10的芽孢產(chǎn)率為93.2%。該驗證試驗表明A2B1C2D1組合的芽孢產(chǎn)率高于項目10的芽孢產(chǎn)率，即該組合為該菌株培養(yǎng)條件的最優(yōu)組合。確定最適培養(yǎng)條件是：pH值7.2，裝液量50 ml/250 ml，發(fā)酵時間48 h，接種量4%。

綜上所述，菌株F-1的最適種齡為16 h；最適培養(yǎng)基：蔗糖0.5%、牛肉浸膏5%、FeCl30.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、NaH2PO4·H2O 0.03%、K2HPO40.05%、MnSO4·H2O 0.02%。最適培養(yǎng)條件：pH值7.2，裝液量50 ml/250 ml，發(fā)酵時間48 h，接種量4%，在此條件下發(fā)酵，芽孢產(chǎn)率達到96.5%。

3 討論

動物本身的健康情況可以通過臟器的色澤和病變情況反映出來[11]。在小白鼠的毒性試驗中，通過對肝臟和腎臟的色澤以及對這些臟器縱切剖面觀察，發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠的肝臟和腎臟均與對照組一致，未發(fā)現(xiàn)臟器的不良病變。這表明本次試驗所選用的F-1菌株較安全，不會造成肝臟和腎臟的腫大和中毒性病變，可以應用于棉籽餅的脫毒。

微生物發(fā)酵法對棉籽餅脫毒的關(guān)鍵是菌種的選擇，近20年來人們篩選出了很多株的棉酚降解菌株，如鐘英長等[12]、施安輝等[13]、楊景芝等[14]、楊繼良等[15]、肖永友等[16]均篩選出對棉酚具有降解作用的菌株，但大多數(shù)是霉菌和酵母菌。本研究使用的棉酚降解菌株F-1屬于枯草芽孢桿菌，此菌株的獲得極大地豐富了棉酚降解菌的種類。為了將F-1菌株應用于實際生產(chǎn)，可以將其制成脫毒菌劑。芽孢桿菌菌劑具有易加工、生產(chǎn)成本低、儲存期長、使用方便等諸多優(yōu)點，因此廣泛應用于實際生產(chǎn)中。F-1菌株作為一株枯草芽孢桿菌菌株，以內(nèi)生芽孢的形式存在，可以耐受菌劑生產(chǎn)加工過程中的高溫、高壓、酸堿等不利條件的影響，在菌劑中性狀穩(wěn)定，而且可以在適宜的條件下萌發(fā)成營養(yǎng)細胞發(fā)揮作用，所以提高F-1菌株的產(chǎn)芽孢能力是研究棉籽餅脫毒菌劑的關(guān)鍵。因此，我們采用單因子和正交試驗的方法使芽孢產(chǎn)率達到96.5%，為制成棉籽餅脫毒菌劑的進一步研究與應用奠定了基礎。