郇惠杰，鐘泓波，雷芬芬，崔 春，趙謀明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

蛋白酶是一類非常重要的水解酶，是三大工業(yè)用酶之一，銷售額約占全球酶制劑市場(chǎng)的60%。其中，來(lái)源于細(xì)菌的蛋白酶比來(lái)源于動(dòng)物和真菌的更具有前景，占據(jù)了世界市場(chǎng)的20%，主要用于蛋白質(zhì)深加工、皮革、醫(yī)藥、洗滌劑、飼料等行業(yè)中[1-2]。

海洋是生命的發(fā)源地，它占據(jù)了地球表面積的70%，包含了地球生物資源的80%。由于海洋環(huán)境的特殊性（高鹽、高壓、低溫、營(yíng)養(yǎng)稀缺等），海洋微生物與陸生微生物在代謝系統(tǒng)與防御體上有著明顯的差異，是獲取新型酶，如極端酶，特別是耐鹽、耐堿、耐熱、耐冷蛋白酶的重要資源庫(kù)[3-4]。1972年Nabou Kato等[5]首次報(bào)道了海洋來(lái)源的蛋白酶，之后一些可用于新型工業(yè)的海洋微生物酶被相繼報(bào)道。然而，由于受到產(chǎn)酶海洋微生物樣品采集和開發(fā)技術(shù)的限制，該領(lǐng)域的發(fā)展緩慢。近年來(lái)，借助于海洋生物高新技術(shù)，海洋生物酶研究得到了快速的發(fā)展。國(guó)內(nèi)外從海洋細(xì)菌、真菌、霉菌等微生物中分離得到多種具有開發(fā)潛力的酶制劑。目前，已報(bào)道的海洋微生物酶有：蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、DNA聚合酶、溶菌酶等。本文從深海海泥中篩選出產(chǎn)蛋白酶活力高且具有耐鹽性的細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行微生物學(xué)鑒定，研究其所產(chǎn)蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為工業(yè)生產(chǎn)、應(yīng)用提供新的菌株與酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 不同經(jīng)緯度、不同取樣方式的中國(guó)南海深海海泥中篩選，具體信息如表1所示；酪氨酸Sigma公司；酵母粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Alcalase、木瓜蛋白酶、水解蛋白酶FG、胰酶、復(fù)合蛋白酶 諾維信；蔗糖酯類S-1670、S-170、SE-15、1170

丹尼斯克；吐溫-80 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙三醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Folin試劑 根據(jù)參考文獻(xiàn)自配[6]；其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純；富集、活化培養(yǎng)基 Zobell 2216 E培養(yǎng)基；酪蛋白固體培養(yǎng)基 酪蛋白10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、K2HPO42.0g、瓊脂15.0g、蒸餾水1L，pH 7.4；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖5.0g、酵母粉10.0g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O 0.3g、（NH4）2SO41.0g、CaCl21.0g、NaCl 1.0g、蒸餾水1L，pH 7.2。

PHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HZQ-X300C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計(jì)尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩 稱2g海泥于50m L錐形瓶中，加入10m L無(wú)菌水于37℃，150r/m in的培養(yǎng)箱中振蕩20m in，靜置一段時(shí)間，取1m L上清液于富集培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h。用生理鹽水按10倍稀釋法將富集培養(yǎng)后的菌懸液稀釋至10-8。分別取0.1m L 10-6～10-8稀釋液，涂布于酪蛋白平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)48h后，挑選產(chǎn)生明顯水解圈的菌株進(jìn)行劃線分離純化。

1.2.2 菌株復(fù)篩 挑取在斜面上分離純化后的菌株，將其轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，25℃，150r/min條件下培養(yǎng)12h。以1%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中（25m L/250m L錐形瓶），25℃，150r/m in培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液在10000r/min，4℃條件下離心10min，過濾制得粗酶液。測(cè)定粗酶液的蛋白酶活力，選取蛋白酶活力最高的菌株進(jìn)行下一步研究。

1.2.3 蛋白酶活定義及計(jì)算 1m L酶液在40℃，pH 7.2的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μg酪氨酸所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活單位（U）[7-8]。

A=105.24ΔOD660-1.8888

酶活力（U/m L）=A（4/10）n

式中：ΔOD660：660nm處樣品測(cè)定與空白實(shí)驗(yàn)光密度值之差；A：福林試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線中，不同ΔOD660對(duì)應(yīng)的值；4：反應(yīng)體系總體積，m L；10：反應(yīng)時(shí)間，min；n：酶液稀釋的倍數(shù)。

1.2.4 蛋白酶活測(cè)定 采用福林-酚法顯色法測(cè)定蛋白酶活[9]。具體步驟為：將pH 7.2的2%酪蛋白溶液放入40℃恒溫水浴中預(yù)熱5m in；將粗酶液按一定倍數(shù)稀釋；在樣品管與空白管中各加入1.0m L稀釋液；樣品管中加入1.0m L酪蛋白，混勻；40℃保溫；10min后在樣品管中加入2.0m L三氯乙酸（TCA）終止酶促反應(yīng)，保溫20m in；離心，取1.0m L上清液，加入5.0m L 0.4mol/L Na2CO3溶液，F(xiàn)olin試劑1.0m L，40℃顯色20min；紫外分光光度計(jì)測(cè)定在660nm下的吸光值?？瞻坠苤邢燃尤隩CA，再加酪蛋白，其他步驟同上。空白、樣品管一式三份。

1.2.5 16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增 用16S rDNA通用引物Eubac27F：5’-AGAGTTTATCCTGGCTCAG-3’；和Eubac1492：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5m in，然后95℃30s，55℃30s，72℃1.5m in，循環(huán)24次；72℃延伸10m in。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 菌體生物量測(cè)定 紫外可見分光光度計(jì)于600nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光值（OD），作為菌體生物量的衡量指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋細(xì)菌篩選結(jié)果

復(fù)篩過程中，蛋白酶活力最高的為90U/m L，篩選此菌株的海泥樣品號(hào)為11E109B。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 將C-7菌種劃線接種于酪蛋白平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，肉眼觀察菌落的形態(tài)與特征，并在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果如表2所示。

表1 中國(guó)南海深海海泥采集信息Table1 The information of seamud from the South China Sea

表2 菌株形態(tài)特征Table2 Morphological characteristics

2.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 C-7各項(xiàng)生理生化指標(biāo)如表3所示。

表3 生理生化特征Table3 Physiological and biochemical characteristics

結(jié)果表明，海洋細(xì)菌C-7具有較好的氯化鈉耐受性，可以水解明膠，能夠利用淀粉、果糖、葡萄糖、甘露醇等碳源，在硫酸銨與硝酸銨中均能夠生長(zhǎng)。

2.2.3 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析 將16S rDNA全序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST軟件進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株與蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis strain的同源性達(dá)到99%。采用ClustalW和MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。

圖1 C-7的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of C-7

由圖1可知，該菌株與Bacillus thuringiensis同屬一個(gè)分支。結(jié)合菌株菌落形態(tài)、生理生化鑒定結(jié)果，鑒定菌株C-7為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

2.3 菌株C-7所產(chǎn)蛋白酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 溫度對(duì)所產(chǎn)蛋白酶活影響 將稀釋了一定倍數(shù)的粗酶液置于20、30、40、50、60℃下，分別測(cè)定所產(chǎn)蛋白酶活，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)所產(chǎn)蛋白酶活影響Fig.2 Effectof temperature on enzyme activity

結(jié)果表明，該酶在40～50℃范圍內(nèi)有較高蛋白酶活，最適作用溫度為50℃，屬于中溫蛋白酶。

2.3.2 pH對(duì)所產(chǎn)蛋白酶活影響 配制pH為5、6、7、8、9、10、11、12的2%的酪蛋白溶液，分別測(cè)粗酶液在不同pH條件下的蛋白酶活。測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)所產(chǎn)蛋白酶活影響Fig.3 Effect of pH on enzyme activity

結(jié)果表明，C-7所產(chǎn)蛋白酶活隨pH的增大先增高后降低，pH在7～8處均具有較高蛋白酶活，在pH 7處達(dá)最大值，由此推斷該菌株所產(chǎn)蛋白酶屬于中性蛋白酶。

2.3.3 NaCl濃度對(duì)所產(chǎn)蛋白酶活的影響 NAN-WEI SU等[10]研究了NaCl濃度對(duì)蛋白酶活的影響，結(jié)果表明，NaCl濃度對(duì)蛋白酶活具有顯著影響，一株米曲霉所產(chǎn)蛋白酶在18%NaCl條件下，酶活僅殘存3%，嚴(yán)重影響了其酶解效果。實(shí)驗(yàn)分別在NaCl濃度為0%、15%、18%的條件下，比較自制蛋白酶與商業(yè)蛋白酶的耐鹽性（將0%NaCl條件下的相對(duì)蛋白酶活定為1）。結(jié)果如圖4所示。

圖4 NaCl濃度對(duì)不同蛋白酶影響Fig.4 Effectof NaCl concentration on enzyme activity

結(jié)果表明，所選5種商業(yè)酶與自制蛋白酶在NaCl濃度遞增的條件下均有不同程度的失活，與K lomk lao等[11]的研究結(jié)果相符。當(dāng)鹽濃度為15%時(shí)，自制蛋白酶酶活（殘留43%）與胰酶酶活（殘留42%）耐鹽性相當(dāng)，比復(fù)合蛋白酶酶活（殘留26%）耐鹽性好；當(dāng)鹽濃度為18%時(shí)，自制蛋白酶（殘留32%）比復(fù)合蛋白酶耐鹽性（殘留17%）好。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.4.1 碳源的確定 碳源對(duì)蛋白酶生產(chǎn)的影響比較復(fù)雜，除了供給微生物生長(zhǎng)所需要的碳源和能量外，通常情況下對(duì)細(xì)菌產(chǎn)酶還具有誘導(dǎo)和阻遏作用。為了提高酶活，應(yīng)選擇對(duì)蛋白酶有誘導(dǎo)作用，而無(wú)阻遏作用或者阻遏作用小的物質(zhì)作為碳源[12]。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加與葡萄糖等量的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米粉、麩皮，其他條件完全相同，測(cè)定粗酶液酶活及生物量。結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同碳源的產(chǎn)酶情況Fig.5 Different carbon sources effecton enzyme activity

結(jié)果表明，以葡萄糖為碳源時(shí)，所產(chǎn)蛋白酶活最高，其對(duì)蛋白酶的誘導(dǎo)作用最為明顯，確定該菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為葡萄糖。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以相同的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)所篩菌株進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，生物量與所產(chǎn)蛋白酶活之間具有一定的相關(guān)性，生物量高時(shí)所產(chǎn)蛋白酶活不一定高，但生物量低時(shí)所產(chǎn)蛋白酶活一定低。

2.4.2 氮源的確定 影響蛋白酶產(chǎn)量的另外一個(gè)重要因素為氮源。在添加最佳碳源的基礎(chǔ)上，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加與酵母粉等量的蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、牛肉膏、尿素、硝酸銨，其他條件完全相同，測(cè)粗酶液酶活及生物量。結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同氮源的產(chǎn)酶情況Fig.6 Differentnitrogen sources effecton enzyme activity

結(jié)果表明，該菌株在添加無(wú)機(jī)氮的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到限制，產(chǎn)酶能力也顯著下降，與陳鴻圖[12]的研究結(jié)果一致。而在蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、牛肉膏中生長(zhǎng)良好，對(duì)其所產(chǎn)蛋白酶活均有不同程度的提高。其中，蛋白胨對(duì)所產(chǎn)蛋白酶提高效果最為顯著，其次是大豆粕，但由于大豆粕不溶于水，考慮到實(shí)驗(yàn)操作的方便性，最終確定蛋白胨為最佳氮源。

2.4.3 NaCl濃度的確定 在添加最佳碳、氮源的基礎(chǔ)上，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同體積分?jǐn)?shù)的NaCl，分別為0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，測(cè)粗酶液酶活及生物量。結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同濃度NaCl的產(chǎn)酶情況Fig.7 Different NaCl concentration effecton enzyme activity

結(jié)果表明，在一定NaCl濃度范圍內(nèi)，蛋白酶活隨著NaCl濃度的增加而升高，當(dāng)NaCl濃度為1%時(shí)，促進(jìn)產(chǎn)蛋白酶效果最顯著。超過一定的濃度范圍，隨著NaCl濃度的增大，菌體生物量減少，所產(chǎn)蛋白酶活也逐漸降低。

2.4.4 無(wú)機(jī)鹽及濃度的優(yōu)化 在已優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別減少基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中4種無(wú)機(jī)鹽的一種，測(cè)其粗酶液蛋白酶活及生物量，確定對(duì)所產(chǎn)蛋白酶活有促進(jìn)作用的無(wú)機(jī)鹽。結(jié)果見圖8。

圖8 不同無(wú)機(jī)鹽種類的產(chǎn)酶情況Fig.8 Different inorganic salteffecton enzyme activity

結(jié)果表明，CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2PO4對(duì)所產(chǎn)蛋白酶均有一定的促進(jìn)作用，這是主要是因?yàn)镃a2+、K+、Mg2+可起到穩(wěn)定酶、提高酶的耐熱性的作用，與包巨南等[13]的研究一致，李川川等[14]研究的海洋弧菌Vibrio sp.pro1中，Mg2+對(duì)其產(chǎn)酶具有明顯的促進(jìn)作用。本研究中Ca2+對(duì)所產(chǎn)蛋白酶的影響最為顯著，而（NH4）2SO4對(duì)所產(chǎn)蛋白酶有一定的抑制作用，故將其舍去，下一部實(shí)驗(yàn)選取Ca2+進(jìn)行濃度實(shí)驗(yàn)。

對(duì)Ca2+按0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的添加量添加到發(fā)酵培養(yǎng)中，測(cè)定粗酶液酶活及生物量，結(jié)果見圖9。

圖9 不同CaCl2濃度的產(chǎn)酶情況Fig.9 Different CaCl2 concentration effect on enzyme activity

結(jié)果表明，隨著Ca2+濃度的增加，產(chǎn)酶受到抑制，當(dāng)CaCl2濃度為0.05%時(shí)所產(chǎn)蛋白酶活最高。

2.4.5 表面活性劑的確定 在已優(yōu)化的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中分別添加0.15%的蔗糖酯類S-1670、S-170、SE-15、1170、吐溫-80、甘油。結(jié)果如圖10所示。

圖10 不同表面活性劑的產(chǎn)酶情況Fig.1 0 Different surfactanteffecton enzyme activity

結(jié)果表明，S-1670、SE-15、1170及吐溫-80對(duì)所產(chǎn)蛋白酶均有一定的促進(jìn)作用，這主要是因?yàn)楸砻婊钚詣┛稍黾蛹?xì)胞的通透性，進(jìn)而提高分泌蛋白的表達(dá)量[15]。其中S-1670和吐溫-80的促進(jìn)作用最為顯著，但由于S-1670溶解性較差，而吐溫-80在水中溶解性較好，綜合考慮選擇吐溫-80。

綜上，發(fā)酵培養(yǎng)基確定為：葡萄糖5.0g，蛋白胨10.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 10.0g，CaCl20.5g，吐溫-80 1.5g，蒸餾水1L，pH 7.2。此時(shí)，所產(chǎn)蛋白酶酶活由初篩的90U/m L提高到了318U/m L。

3 結(jié)論

本研究從南海深海海泥中篩選出一株產(chǎn)蛋白酶活最高的細(xì)菌C-7，結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA基因序列鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH 7，屬于中溫中性蛋白酶，該蛋白酶在15%NaCl條件下仍能保持原有酶活的43%，具有良好的耐鹽性。最終確定產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基為：葡萄糖5.0g，蛋白胨10.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 10.0g，CaCl20.5g，吐溫-80 1.5g，蒸餾水1L，pH 7.2。

大豆粕為價(jià)格低廉的植物蛋白質(zhì)，本研究中的菌株在以大豆粕為氮源的條件下，生長(zhǎng)良好，與最佳氮源蛋白胨所產(chǎn)蛋白酶活相當(dāng)，若將其用于工業(yè)發(fā)酵，可以大大降低成本，具有很好的開發(fā)前景。

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