張豐香，李清華，王 霞，周 健

（濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濰坊261053）

1965年Ferreira從巴西蝮蛇（Bathrops jararaca）蛇毒里分離出被稱為“緩激肽增強(qiáng)肽”的多肽物質(zhì)，它能夠增強(qiáng)舒緩激肽的舒張血管的作用，之后發(fā)現(xiàn)此肽類也能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE）活性，從而具有降血壓作用，從此開啟了對(duì)ACE抑制肽的研究大門。目前已研究發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽的來(lái)源有酪蛋白、大豆蛋白、膠原蛋白、魚貝類肌肉蛋白、玉米蛋白、酒糟、大蒜等[1-6]。研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于食物蛋白的ACE抑制肽活性與肽的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，主要分為兩個(gè)方面：氨基酸的序列和肽鏈的大小，通常認(rèn)為ACE抑制肽主要集中在相對(duì)分子質(zhì)量較?。?500以下）的部份[7]。肽的氨基酸序列由來(lái)源的食物種類決定，很難通過(guò)外界條件改變。而肽鏈的大小或長(zhǎng)短可以通過(guò)加工條件加以改變。目前將大分子蛋白加工成小分子多肽的方法主要有兩種：一是通過(guò)化學(xué)方法（加熱和酸堿處理），化學(xué)合成法可按人們的意愿合成任意活性肽，廣泛用于生產(chǎn)高價(jià)的藥理級(jí)肽，但成本高，而且副產(chǎn)物及殘留化合物等對(duì)人體有害；二是通過(guò)體外酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生，包括直接酶解和利用微生物發(fā)酵間接酶解兩類，酶法生產(chǎn)生物活性肽具有很多優(yōu)點(diǎn)，即生產(chǎn)條件溫和、安全性高、價(jià)廉且能夠進(jìn)行定位水解分裂得到特定的活性肽，因而目前酶法在生物活性肽生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，近幾年報(bào)道的活性肽的制備方法皆為酶解法。魚鱗是魚加工的下腳料之一，富含膠原和羥基磷灰石，目前大多數(shù)魚鱗并沒有被充分利用，而是當(dāng)作廢棄物被扔掉，據(jù)估計(jì)，我國(guó)每年廢氣的魚鱗達(dá)30萬(wàn)t[8]，這不僅造成資源的巨大浪費(fèi)，而且造成環(huán)境污染。為此，魚鱗資源的開發(fā)利用備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)擬采用酶法將魚鱗開發(fā)成具有較高ACE抑制活性的魚鱗多肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚鱗 新鮮的草魚魚鱗收集于水產(chǎn)市場(chǎng)；Protease N、Proleather FG-F日本天野酶制品株式會(huì)社；中性蛋白酶 索萊寶公司；A lcalase 3.0T 丹麥諾維信（Novo）公司；木瓜蛋白酶 上海生物試劑公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（hippuryl-L-His-Leu） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑 均為分析純。

Agilent 1100型安捷倫液相色譜儀 美國(guó)安捷倫；LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 京四環(huán)科學(xué)儀器廠；812型磁力恒溫?cái)嚢杵?上海曹縣行無(wú)線電元件廠；pHS-2型酸度計(jì) 上海第二分析儀器廠；超級(jí)恒溫水浴 上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠；DFT-200型手提式中藥粉碎機(jī) 浙江溫嶺大德中藥機(jī)械有限公司。

1.2 原料及預(yù)處理

將魚鱗清洗干凈后，用10%的鹽溶液浸泡24h，中間換液一次，之后用0.4mol/L的HCl脫鈣90min，將預(yù)處理后的魚鱗冷凍干燥，用手提式中藥粉碎機(jī)粉碎后儲(chǔ)藏備用。

1.3 魚鱗粉成分分析[9]

灰分：灼燒法；粗蛋白質(zhì)：凱氏定氮法，轉(zhuǎn)化系數(shù)取5.55[10]；總糖：苯酚-硫酸法；粗脂肪：索氏抽提法。

1.4 酶解工藝

表1 商品酶制劑的特性及酶活Table1 The specificity and activities of the commercial protease

不同商品蛋白酶對(duì)魚鱗酶解效果的比較：稱取粉碎的魚鱗5g，放入恒溫酶反應(yīng)器中，加水95m L，將溶液溫度和pH調(diào)到每種酶的最適值，酶的添加量為3000U/g底物，酶解過(guò)程不斷攪拌，并不斷加入0.5mol/L NaOH以使反應(yīng)體系的pH變化維持在實(shí)驗(yàn)規(guī)定值范圍內(nèi)，用pH-stat法測(cè)定其不同時(shí)間內(nèi)的水解度，水解反應(yīng)終止時(shí)用沸水浴滅酶15m in（對(duì)A lcalase進(jìn)行滅活時(shí)將反應(yīng)體系的pH降到4.0并且保持20min）。冷卻后以10000×g離心30m in，取上清液經(jīng)濃縮后冷凍干燥。各種酶的特性及酶活力見表1。

酶的添加量對(duì)水解度的影響：在相同的底物濃度（5%）以及各種酶的最適反應(yīng)溫度和pH條件下，改變酶的添加量（2%、4%、6%、8%底物重量），酶解3h，用pH-stat法測(cè)定其水解度，其他操作同上。

確定魚鱗最佳酶解條件：選定蛋白酶的種類后，在一定底物濃度（5%）和一定酶解時(shí)間（3h）下，以酶用量（[E]/[S]）、酶解溫度（T）和pH 3個(gè)因素作為因變量，設(shè)計(jì)三因素三水平的二次回歸方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，因素及水平見表2，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解條件。響應(yīng)值為魚鱗膠原蛋白水解度（Degree of hydrolysis，DH），采用pH-stat法計(jì)算水解度[11]，水解度的計(jì)算公式如下：

式中：B—堿液體積（m L or L）；Nb—堿液的摩爾濃度；α—α-氨基的平均解離度；MP—底物中蛋白質(zhì)總量（g或kg）；htot—底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)（mmol/g蛋白質(zhì)）；對(duì)魚膠原蛋白而言，htot=9.1（mmol/g蛋白質(zhì)）（根據(jù)膠原蛋白氨基酸組成計(jì)算得到）。

表2 魚鱗酶解工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平表Table2 Table of factors and levels of the experiment design for enzyme hydrolysis of fish scales

1.5 魚鱗肽相對(duì)分子量分布的測(cè)定

儀器：Waters 600高效液相色譜儀（配2487紫外檢測(cè)器和M 32工作站）；色譜柱：TSKgel2000 SWXL 300mm×7.8mm；流動(dòng)相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V）；檢測(cè)：UV220nm；流速：0.5m L/m in；柱溫：30℃。干燥后的魚鱗酶解產(chǎn)物配成濃度0.5mg/m L，進(jìn)樣體積：20μL。

相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C（MW12500u）；抑肽酶（MW6500u）；桿菌酶（MW1450u）；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451u）；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189u）。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程為：Log Mol W t=6.68-0.193T（T為保留時(shí)間），R2=0.9982。用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進(jìn)行計(jì)算，即可得到樣品肽的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布范圍。用峰面積歸一化法可計(jì)算不同相對(duì)分子質(zhì)量肽的近似百分含量。

1.6 氨基酸組成及游離氨基酸的測(cè)定

1.6.1 氨基酸組成的測(cè)定的樣品預(yù)處理 稱0.2g左右脫鈣后的魚鱗膠原纖維樣品于水解管中，加入6mol/L HCl，抽真空，封口，110℃水解24h。轉(zhuǎn)移定容后過(guò)濾，取濾液在加NaOH的真空干燥器中蒸干，加鹽酸溶解，上機(jī)測(cè)定。

1.6.2 游離氨基酸測(cè)定的樣品預(yù)處理 稱取約0.3g酶解產(chǎn)物，溶于10m L 3.5%磺基水楊酸中，定容至50m L，室溫下靜置2h，用濾紙過(guò)濾，吸取1m L濾液10，000r/m in離心15min，取清液上機(jī)測(cè)定。

1.6.3 采用安捷倫1100氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定 色譜條件：4.0mm×125mm C18柱；柱溫40℃；流速1.0m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)338nm，262nm（Pro）；流動(dòng)相A：20mmol醋酸鈉液，B：20mmol醋酸鈉液∶甲醇∶乙腈＝1∶2∶2（v/v）。

在相同的色譜條件下，與已知濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積相比較，計(jì)算出樣品相應(yīng)氨基酸的含量。

1.7 酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的測(cè)定

ACE的活性測(cè)定采用色譜法，具體方法參照Shu Hua Xia[12]所寫。ACE抑制活性計(jì)算式為：

ACE活性抑制率（%）=（空白對(duì)照的馬尿酸峰值-樣品的馬尿酸峰值）/空白對(duì)照的馬尿酸峰值×100

實(shí)驗(yàn)所采用的酶解樣品的濃度為1.5mg/m L。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SPSS for W indows（version 13.0）軟件進(jìn)行方差分析，p＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 經(jīng)脫鈣處理后魚鱗的主要成分

魚鱗是魚體與外界接觸的邊緣組織，是魚類真皮層膠原質(zhì)經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化而形成的骨質(zhì)衍生物，學(xué)名為魚鱗硬蛋白，主要有羥基磷灰石Ca10（OH）2（PO4）6和膠原纖維組成[13]。因此當(dāng)其中的羥基磷灰石被鹽酸浸出后，其主要的成分就是蛋白質(zhì)——魚鱗膠原，約占脫鈣魚鱗的90%，其次為水分含量，約為10%，灰分含量不足1%，表明魚鱗脫鈣比較徹底，總糖含量不足1%，脂肪幾乎檢測(cè)不到，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 經(jīng)脫鈣冷凍干燥后魚鱗的主要成分（%，w/w）Table3 Basic components of demineralized grass carp fish scales（%，w/w）

2.2 不同商品蛋白酶對(duì)魚鱗酶解效果的比較

酶的專一性決定了某種蛋白酶可能只作用于某些肽鍵或帶有某種基團(tuán)的氨基酸所形成的肽鍵，酶的種類不同底物特異性和作用位點(diǎn)也就不同，這就直接決定了酶解產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)和功能，因此從眾多的蛋白酶中篩選合適的蛋白酶成為酶解法制備活性肽的關(guān)鍵。

蛋白酶按來(lái)源不同可分為動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶，其中微生物蛋白酶由于生產(chǎn)便捷、酶活高而成本低被認(rèn)為是較為理想的酶源。選擇待篩酶種時(shí)要考慮原料與目標(biāo)產(chǎn)物的特性，使得到的酶解產(chǎn)物具有較好的得率、組成和活性，這樣才能為后續(xù)的分離步驟打下良好的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)魚鱗膠原的特性和目標(biāo)ACE抑制肽是短肽的特點(diǎn)，選用了中性和堿性內(nèi)切酶共5種，酶的特性見表1。除木瓜蛋白酶為植物蛋白酶外，其他均為微生物蛋白酶。

以魚鱗膠原蛋白水解度（DH）為指標(biāo)，水解度越大表明大分子蛋白被水解的越徹底，且本實(shí)驗(yàn)選用的蛋白酶主要是內(nèi)切酶，因此，水解度加大，短肽含量也會(huì)增加。在相同的酶活與底物濃度比（3000U/g魚鱗，底物濃度5%）以及各自最適條件下，對(duì)這五種蛋白酶酶解魚鱗的能力進(jìn)行了比較，結(jié)果見圖1。從圖中可看出Protase N、中性蛋白酶和A lcalase對(duì)魚鱗的水解能力較強(qiáng)，這三種蛋白酶能使魚鱗全部水解，形成透明溶液，水解度高于其他兩種蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶酶解魚鱗的進(jìn)程曲線Fig.1 Hydrolysis curves for fish scales collagen with different proteases

2.3 酶的添加量對(duì)水解度的影響以及酶種類的選擇

固定底物濃度（5%），改變Protase N、中性蛋白酶和Alcalase的加酶量，觀察其在最適作用條件下對(duì)魚鱗膠原的水解能力（酶解3h），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。改變A lcalase蛋白酶的添加量對(duì)水解度的影響并不顯著（p＞0.05），水解度維持在12%左右，這可能由于對(duì)該底物濃度A lcalase蛋白酶的添加量已過(guò)多或者Alcalase蛋白酶對(duì)魚鱗膠原的作用位點(diǎn)較少。水解度隨著中性蛋白酶和Protase N量的增加而增加，但當(dāng)加酶量超過(guò)6%時(shí)，再增加加酶量，兩者的水解度都不會(huì)有顯著的增加（p＞0.05），最終達(dá)到的水解度約為16%。

圖2 酶的添加量對(duì)魚鱗膠原水解度的影響Fig.2 The effects of amountof enzymes on the DH of the fish scales collagen

在相同的水解度下，由于酶的作用位點(diǎn)不同，水解產(chǎn)物會(huì)以肽和游離氨基酸兩種形式存在，這兩種形式都可以被人體直接吸收，但吸收方式有很大差別。肽主要通過(guò)腸道黏膜的運(yùn)輸方式被人體吸收，其中寡肽的吸收更為快速高效[14-15]，且研究發(fā)現(xiàn)肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)目與其活性有很大關(guān)系[16-17]。但如果水解產(chǎn)物當(dāng)中的游離氨基酸過(guò)高，其高滲透性甚至有可能造成腹瀉[18]。因此對(duì)中性蛋白酶與Protase N蛋白酶的水解產(chǎn)物的分子量分布及游離氨基酸的含量進(jìn)行了分析，見圖3和表4。

圖3 Protease N酶解產(chǎn)物和中性蛋白酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig.3 Themolecularweight distribution of Protease N and neutral protease hydrolysates

表4 酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布及游離氨基酸的含量Table4 Themolecularweight distribution and contentof free amino acids of hydrolysates

圖3與表4為水解度為16%時(shí)中性蛋白酶與Protase N蛋白酶兩種酶解產(chǎn)物的分子量分布及游離氨基酸的含量。從中可以得出，在相同水解度下，中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物的寡肽含量高一些，游離氨基酸的含量低一些。這說(shuō)明利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的中性蛋白酶對(duì)魚鱗膠原有較好的水解能力。

為進(jìn)一步確定最佳的酶種類，對(duì)這兩種酶的酶解產(chǎn)物的ACE抑制率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。從表5中可知，在相同水解度下，相同濃度的（1.5mg/m L）中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性顯著高于Protease N的酶解產(chǎn)物（p＜0.01），這可能是酶對(duì)底物的特異性及作用位點(diǎn)的差異所導(dǎo)致的。且隨著水解度的增加兩種酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性也隨之顯著增加（p＜0.01），通常認(rèn)為具有ACE抑制活性肽其相對(duì)分子質(zhì)量較小，而這一結(jié)果也與表4的結(jié)果相吻合。

表5 不同水解度下酶解產(chǎn)物的ACE抑制率（%）Table5 The ACE inhibitor activities of hydrolysates on different DH（%）

2.4 酶解條件的優(yōu)化

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇來(lái)源于枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶水解魚鱗制備ACE抑制活性肽。又因?yàn)閷?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度越高，ACE抑制活性也越高，且短肽含量越高，游離氨基酸含量越少，因此優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以魚鱗的水解度為指標(biāo)，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法來(lái)確定最佳的酶解工藝條件，使其水解度達(dá)到最大值。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table6 Response surfacemethodology design and experimental results

影響酶解過(guò)程的主要因素有pH、溫度、加酶量（[E]/[S]）、底物濃度（[S]）及酶解時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)高的底物濃度會(huì)產(chǎn)生抑制作用，因此選擇底物濃度為5%。從不同蛋白酶酶解魚鱗的進(jìn)程曲線可以看出當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)3h，水解度幾乎不再發(fā)生變化，因此確定酶解時(shí)間為3h，可避免過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間造成過(guò)多的游離氨基酸地產(chǎn)生和能源地消耗。以pH、酶解溫度（T）和酶用量（[E]/[S]）3個(gè)因素作為因變量，以水解度作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的二次回歸方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析法確定最佳的酶解條件。溫度（T）、pH和加酶量（[E]/[S]）三個(gè)因素的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表7 響應(yīng)值水解度（DH）回歸模型的方差分析Table7 Analysis of variance for regressmodels of response DH

2.5 回歸分析

對(duì)表6中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert?6軟件（美國(guó)Stat-Ease公司軟件）進(jìn)行回歸分析。響應(yīng)值水解度（DH）Y的回歸方程模型方差分析見表7。結(jié)果表明，響應(yīng)面的二次方程回歸模型F檢驗(yàn)呈高度顯著（p＜0.001），相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9931，并且失擬項(xiàng)F檢驗(yàn)不顯著，實(shí)驗(yàn)的誤差小，表明二次回歸方程模型適用于酶解魚鱗制備ACE抑制肽的實(shí)驗(yàn)條件的理論分析預(yù)測(cè)。回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)及F檢驗(yàn)值見表8，從表8可見，溫度、pH和加酶量（[E]/[S]）的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)的F檢驗(yàn)均呈顯著性，而交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著，說(shuō)明響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個(gè)具體因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是存在二次關(guān)系，Y的回歸方程為：Y=18.96-1.07X1+2.74X2+0.68X3-4.70X-5.51X-2.62X-0.02X1X2+0.35X1X3+0.087X2X3。

表8 回歸系數(shù)極其顯著性檢驗(yàn)Table8 Regression coefficients and its significant levels

圖4為各影響因素在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)響應(yīng)值的響應(yīng)面圖和等值線圖，由圖4可以直觀的看出pH、溫度和加酶量對(duì)水解度的影響。隨著pH的增大，DH值先增加后下降，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在酶水解的最佳pH，低于或高于該值，酶的活力都受到影響。低的pH有利于提高酶解反應(yīng)速率；隨著溫度的提高，DH值增大，當(dāng)溫度超過(guò)50℃后，DH值則略有下降，這主要是因?yàn)檫^(guò)高的反應(yīng)溫度引起酶的失活；加大酶的用量DH值也隨之明顯提高，但受溫度和pH的影響，水解度也呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。因此在所選的因素水平范圍內(nèi)，存在最佳的酶解條件使水解度達(dá)到最大。

圖4 酶解時(shí)間、酶解溫度和加酶量對(duì)水解度的響應(yīng)面圖Fig.4 Effects of hydrolysis time，hydrolysis temperature and amountof enzyme on DH

2.6 最優(yōu)酶解條件的確定及其驗(yàn)證

從因素檢驗(yàn)可以看出，pH對(duì)水解度的影響最大（p＜0.0001），溫度的影響次之，酶濃度的影響在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最小。此外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)雖然加大加酶量能提高水解度，但在加酶量5%（w/w）以上時(shí)水解度增加的并不顯著，考慮到經(jīng)濟(jì)因素，在加酶量5%（w/w）情況下從回歸方程計(jì)算出最佳酶解條件為：溫度50℃，加酶量5%，pH為6.4，水解度值為18.96。在最優(yōu)條件（即：pH 6.4，溫度50℃，加酶量（[E]/[S]）5%，魚鱗濃度[S]5%，水解3h）下，由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得的水解度為19.26%±0.28%（n=3），與回歸方程的擬合結(jié)果十分接近。

2.7 酶解產(chǎn)物的分子量分布與氨基酸分析

在最佳酶解條件下采用中性蛋白酶解魚鱗制備魚鱗ACE抑制肽，并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了氨基酸組成分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定。

酶解產(chǎn)物的氨基酸組成見表9，魚鱗ACE抑制肽富含脯氨酸、甘氨酸，這與魚鱗膠原三股螺旋區(qū)為連續(xù)的Gly-X-Y重復(fù)序列相對(duì)應(yīng)的，其中X、Y是除甘氨酸外的其他氨基酸殘基，X為脯氨酸，Y為羥脯氨酸或羥賴氨酸[19]。此外還含有較多的丙氨酸，缺乏色氨酸，為典型動(dòng)物膠原的氨基酸組成，其疏水性氨基酸約占總氨基酸的28%。

表9 魚鱗酶解產(chǎn)物的氨基酸組成（殘基數(shù)/1000個(gè)）Table9 Amino acid composition of fish scale hydrolysate（residues/1000）

酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布見圖5。相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果表明酶解產(chǎn)物由多種不同相對(duì)分子質(zhì)量的組分組成。其相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在80～800之間，約占80%；相對(duì)分子質(zhì)量大于1300的組分比例約為8.5%；相對(duì)分子質(zhì)量在800～1300的組分比例約為11.8%。由相對(duì)分子質(zhì)量分布可見酶解產(chǎn)物中含2～6個(gè)氨基酸的寡肽比例較高。

圖5 魚鱗膠原蛋白酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig.5 Themolecularweightdistribution of fish scale hydrolysate

3 結(jié)論

本文從五種蛋白酶中選取來(lái)源于枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶酶解魚鱗制備具有較高ACE抑制活性的多肽。并采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法確定其最佳的酶解工藝為：pH 6.4，溫度50℃，加酶量（[E]/[S]）5%，魚鱗濃度[S]5%，水解3h，水解度為19.26%。對(duì)最佳工藝條件下的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其富含脯氨酸和甘氨酸，其次是丙氨酸，缺乏色氨酸，疏水性氨基酸約占總氨基酸的28%。相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在80～800之間，約為2～6個(gè)氨基酸的寡肽。

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