邱佳妹，周愛存

(浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江杭州311300)

馬尾松松針為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)馬尾松(Pinusmassoniana Lamb.)的針葉，別名豬鬃松毛、松毛、山松須，廣泛分布于江蘇、浙江、安徽、河南及長江中下游各省山地。松針用藥歷史悠久，最早記載于《名醫(yī)別錄》上品卷一“松葉，其味苦溫，主治風(fēng)濕痹氣，生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑，延年。”現(xiàn)代研究表明，松針具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抑菌等作用，并廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕病、心腦血管疾病、糖尿病、肥胖病等癥［1-3］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對松針的化學(xué)成分進行了深入研究，從中分離得到多種黃酮及其苷類［4］、木脂素類［5-8］等。有研究表明，松針中黃酮具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂等多種生理功能［9-10］。當前，有關(guān)松針的研究主要集中在提取工藝以及粗提物藥理活性等方面［11-13］，而關(guān)于松針中總黃酮的純化工藝未見有報道。本研究旨在尋找具有一定選擇性、吸附容量大且易于解吸附的樹脂，為分離純化松針總黃酮，充分開發(fā)利用松針資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尾松松針 2011年8月采自浙江湖州和孚鎮(zhèn)，40℃下烘干，剪成1～1.5cm小段裝袋備用;蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院;Amberlite XAD-7HP樹脂 美國羅門哈斯公司;AB-8、HPD-600、HPD-200A樹脂 滄州寶恩化工有限公司;DM130樹脂 杭州爭光樹脂有限公司;Diaion HP-20樹脂日本三菱公司;聚酰胺(30～60目) 華東醫(yī)藥股份有限公司;乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁 華東醫(yī)藥股份有限公司，均為分析純。

玻璃層析柱(Φ25×500mm) 華東醫(yī)藥股份有限公司;UV-2100紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋 嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司;SHZ-95型循環(huán)水多用真空泵 河南予華儀器廠;FA2004A電子天平(萬分之一) 河南兄弟儀器公司;101-A型電熱恒溫干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理 實驗用7種樹脂先用95%乙醇浸泡24h，使之充分溶脹，傾去乙醇以及漂浮物后濕法裝柱，用95%的乙醇以2BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液加等體積的水不變白色渾濁為止;用蒸餾水以同樣流速洗盡乙醇，然后用2BV的5%鹽酸溶液以4～6BV/h流速通過樹脂層，并浸泡2～4h，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性;再用2BV的4%氫氧化鈉溶液以4～6BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4h，最后用水以同樣流速洗至出水pH中性。將預(yù)處理后的樹脂過濾并用濾紙吸干表面水分，于室溫(25℃)下放置24h，即得干樹脂。

1.2.2 松針黃酮提取液的制備 稱取松針50.0g置于圓底燒瓶中，以70%乙醇為提取劑，調(diào)節(jié)提取溶劑pH至10，回流提取2次，每次1h，料液比分別為1∶10、1∶8，過濾，合并兩次提取液，于4℃冰箱中靜置12h。減壓抽濾靜置后的松針提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70℃下減壓回收乙醇至無醇味，用蒸餾水定容至500m L，并用濃HCl調(diào)pH3，即為實驗用TFPMNs提取液。

1.2.3 總黃酮含量測定 精密稱取干燥恒重的蘆丁對照品12.8mg，加蒸餾水溶解并定容至100m L的量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度0.128g/L的對照品溶液。分別精密量取上述蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L于25m L容量瓶中，各用蒸餾水補充至6.0m L，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0m L，搖勻，放置6m in后再各加入10%硝酸鋁1.0m L，搖勻。6m in后再加入1mol/L的氫氧化鈉溶液10m L，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置。10min后于510nm處測吸光度，試劑為空白參比，以吸光度為橫坐標，蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸，得蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度之間的回歸方程:C= 0.0819A+0.0008，R2=0.9995，式中A為吸光度，C為總黃酮濃度(mg/m L)。

液體樣品的測定:先把液體樣品定容至適當體積，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1.0m L，置于10m L容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。再從中取3.0m L于25m L容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、1mol/L的氫氧化鈉，再用蒸餾水定容至刻度，測定吸光度，代入回歸方程計算總黃酮濃度;固體樣品的測定:精密稱取樣品粉末30mg，用蒸餾水定容在50m L容量瓶中，再從中取3.0m L于25m L容量瓶中，按上述方法操作，測定吸光度，計算總黃酮濃度，按式(1)計算固體中總黃酮純度。

式中:P為固體中總黃酮純度(%);Cs為液體中黃酮的濃度(mg/m L);Vs為液體體積(m L);Ms為固體的質(zhì)量。

1.2.4 靜態(tài)吸附實驗

1.2.4.1 樹脂飽和吸附量的測定 準確稱取經(jīng)預(yù)處理的6種干樹脂、聚酰胺各2.0g于具塞磨口三角瓶中，精密加入松針總黃酮提取液20.0m L，密封后室溫下振蕩(180 r/m in)12h至吸附平衡，吸取上層液體測定總黃酮濃度。實驗平行進行三次，取三次實驗數(shù)據(jù)的平均值，并按式2、式3計算飽和吸附量Q和吸附率A:

式中:Q為吸附量(mg/g干樹脂);C0為吸附前溶液濃度(mg/m L);Cr為吸附后溶液濃度(mg/m L); V為溶液體積(m L);W為干樹脂重量(g)。

1.2.4.2 脫附率的測定 將上述吸附飽和后的樹脂過濾，吸干樹脂表面的水分，精密加入80%乙醇10m L，室溫振蕩(180 r/m in)12h，使其達到飽和脫附，濾過后濾液定容，測此時溶液中總黃酮的濃度。實驗平行進行三次，取三次實驗數(shù)據(jù)的平均值，按照式4、式5計算脫附率和回收率:

式中:D為脫附率，R為回收率，CD為脫附液濃度(mg/m L)，C0為樣品中總黃酮濃度(mg/m L)，VD為脫附液體積(m L)，V0為樣品提取液的體積(m L)，W為干樹脂重量(g)，Q為吸附量(mg/g干樹脂)。

1.2.4.3 上柱液濃度的選擇 準確稱取靜態(tài)實驗所篩選的干樹脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，精密加入一定體積的不同濃度的松針總黃酮提取液，其余操作同1.2.4.1。實驗平行進行三次，取三次實驗數(shù)據(jù)的平均值，比較提取液濃度對樹脂吸附性能的影響。

1.2.4.4 上柱液pH的選擇 準確稱取靜態(tài)實驗所篩選的干樹脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，精密加入不同 pH的松針總黃酮提取液20m L，其余操作同1.2.4.1。實驗平行進行三次，取三次實驗數(shù)據(jù)的平均值，比較提取液pH對樹脂吸附性能的影響。

1.2.5 動態(tài)吸附與脫附實驗 稱取靜態(tài)實驗所篩選的干樹脂100mg，經(jīng)預(yù)處理后濕法裝入Φ25×500mm的層析柱中，用蒸餾水洗滌平衡。將TFPMNs提取液稀釋并將pH調(diào)至最佳范圍，得上柱液的總黃酮質(zhì)量濃度為1.1mg/m L。然后以不同流速上樣，分段收集上樣流出液，通過測定流出液中總黃酮含量考察上柱液流速等因素對樹脂吸附性能的影響，確定最佳吸附工藝條件。

對已吸附樣品的樹脂進行脫附實驗，用2BV蒸餾水洗至流出液澄清，用不同濃度的乙醇以一定流速洗脫，收集洗脫液，通過測定流出液中總黃酮含量考察乙醇的濃度、流速等因素對樹脂脫附性能的影響，確定最佳脫附工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樹脂的靜態(tài)吸附實驗結(jié)果

2.1.1 樹脂的初步篩選結(jié)果 7種樹脂對松針總黃酮提取液的吸附-脫附性能實驗結(jié)果見表1。由表1可以看出，Amberlite XAD-7HP和聚酰胺對松針總黃酮的靜態(tài)飽和吸附量均較高，可以達到44.0mg/g以上，可以用于松針總黃酮的吸附。但是，兩種樹脂的脫附率差別較大，Amberlite XAD-7HP樹脂的脫附率為83.7%，明顯高于聚酰胺的脫附率28.1%，表現(xiàn)出最佳的綜合性能。因而，優(yōu)選Amberlite XAD-7HP分離純化TFPMNs。

表1 7種樹脂對TFPMNs靜態(tài)吸附與解吸性能(n=3)Table1 Static adsorption and desorption properties of7 resins for TFPMNs(n=3)

2.1.2 濃度對樹脂吸附性能的影響 總黃酮樣品液的濃度對樹脂Amberlite XAD-7HP吸附性能的影響結(jié)果如表2所示。由表2可知，當松針總黃酮質(zhì)量濃度在1.36～10.84mg/m L區(qū)間內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，樹脂對黃酮的飽和吸附量增大，但是當濃度達到21.68mg/m L時，樹脂的飽和吸附量不增反而微降，可能與溶液濃度過高，粘度過大，影響吸附有關(guān)。綜合考慮，選取10.8mg/m L的黃酮提取液作為最適宜上柱液。

表2 濃度對XAD-7HP樹脂吸附性能的影響(n=3)Table2 Effect of sample concentration on adsorption property of Resin XAD-7HP(n=3)

2.1.3 上柱液pH對樹脂吸附性能的影響 上樣液的pH對樹脂Amberlite XAD-7HP吸附性能的影響結(jié)果如表3所示。由表3可知，隨著松針總黃酮提取液pH的提高，樹脂對總黃酮的飽和吸附量明顯下降。這主要是由于隨著pH的增大，浸提液中的總黃酮以鹽的形式存在而不易被樹脂所吸附，因此應(yīng)盡可能的調(diào)低pH。但是，考慮到提取液的pH太低，容易造成黃酮苷類成分水解，故本實驗選取上柱液的pH為3.0為宜。

2.2 大孔樹脂對松針總黃酮動態(tài)吸附與脫附實驗結(jié)果

2.2.1 上樣流速對樹脂動態(tài)吸附性能的影響 在同一實驗條件下考察不同上樣流速對樹脂動態(tài)吸附性能的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1得知，上樣流速為1～2BV/h時，隨著上樣流速的增大，吸附量變化不大，而當流速在2～4BV/h時，樹脂吸附量隨著流速的增大下降顯著。這可能是由于流速過快，被吸附物質(zhì)分子尚未擴散到樹脂的內(nèi)表面就已泄露。1BV/h時吸附量雖然略高于2BV/h的吸附量，但考慮到1BV/h的上樣速率太慢，上樣耗時太長，故本實驗選用2BV/h的流速進行動態(tài)吸附。經(jīng)實驗得知，一次處理松針總黃酮提取液的體積可達4BV。

表3 pH對樹脂吸附性能的影響(n=3)Table3 Effect of pH value on adsorption property of Resin XAD-7HP(n=3)

圖1 上樣流速對樹脂動態(tài)吸附性能的影響Fig.1 Effect of flow rate on adsorption property of Resin XAD-7HP

2.2.2 洗脫液濃度對脫附性能的影響 在同一實驗條件下考察不同濃度的乙醇洗脫液對樹脂動態(tài)解吸附性能的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2得知，總黃酮脫附率隨著乙醇濃度的增大而增大，80%的乙醇的脫附率可達94.08%，95%乙醇的脫附率為94.69%，兩者相差不大，因此選擇80%的乙醇作為松針總黃酮的脫附劑。

2.2.3 洗脫液流速對脫附性能的影響 在同一實驗條件下考察洗脫液的不同流速對樹脂動態(tài)解吸附性能的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，脫附劑流速越快，脫附性能越差，達到基本脫附完全所需的脫附劑也就越多。從節(jié)省脫附劑的角度考慮應(yīng)盡可能采用低流速洗脫。但洗脫流速太慢，又會使工作周期延長，因此，綜合考慮各因素，選擇1BV/h的洗脫流速為宜。本實驗用2BV的80%乙醇以1BV/h的流速洗脫，脫附率可達93%以上。

圖2 洗脫液濃度對脫附性能的影響Fig.2 Effect of ethanol aqueous solution concentration on desorption propertyof Resin XAD-7HP

圖3 洗脫液流速對脫附性能的影響Fig.3 Effect of eluent flow rate on desorption property of Resin XAD-7HP

2.3 工藝驗證

量取上述馬尾松松針提取液適量，按上述優(yōu)化后的吸附條件和解析條件平行進行三次重復(fù)性實驗，精制后的總黃酮液體經(jīng)減壓濃縮，50℃烘箱中烘干后可得棕黃色的黃酮粉末。以總黃酮回收率及粉末中總黃酮純度為指標，考察工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，粉末中總黃酮的純度提高到65.9%±1.3%，總黃酮回收率可以達80.2%±2.6%，工藝具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

大孔吸附樹脂是一類新型高分子聚合物，在分離化學(xué)成分時具有穩(wěn)定性高、不受無機物存在的影響、再生簡便、環(huán)保節(jié)省費用等優(yōu)點，廣泛地應(yīng)用于單味中藥或復(fù)方中有效部位群以及單體成分的富集純化中。近年來不斷有文獻［14-15］報道大孔吸附樹脂在分離純化黃酮類成分的過程中顯示出卓越的性能。本文選取6種不同性質(zhì)(包括非極性、弱極性、中極性以及極性)的大孔吸附樹脂作為備選樹脂用于TFPMNs的分離純化。此外，亦有文獻［16］報道聚酰胺分離具有酚羥基的黃酮類成分也收到了良好的效果，因此本文也將聚酰胺列為備選樹脂之一進行篩選。以吸附率和解析率為指標，靜態(tài)吸附實驗的結(jié)果表明，Amberlite XAD-7HP對于TFPMNs具有良好的吸附和解析性能，可用于松針總黃酮的分離純化。聚酰胺對TFPMNs雖然也具有較大的吸附容量，但是由于解析率低而予以舍棄。

在本實驗范圍內(nèi)，Amberlite XAD-7HP在室溫條件下分離純化TFPMNs的最佳工藝參數(shù)為:上柱液總黃酮濃度為11mg/m L左右，上柱液pH3，上柱速度2BV/h，溶液處理量4BV/次;脫附劑為80%乙醇，脫附劑的流速 1BV/h，脫附劑用量 2BV。Amberlite XAD-7HP在該條件下對TFPMNs進行純化，總黃酮純度達65.9%±1.3%，總黃酮回收率可達80.2%± 2.6%，顯示出良好的分離純化性能，且工藝穩(wěn)定性良好，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用前景。

本文研究的TFPMNs的純化工藝可為開發(fā)利用馬尾松松針的資源，提高松針產(chǎn)品附加值提供參考依據(jù)。此外，更高純度的TFPMNs的分離純化工藝尚需進一步的研究。

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