楊 楠，梁 琪，*，楊 敏，張衛(wèi)兵，宋雪梅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070; 2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州730070; 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院，甘肅蘭州730070)

在日常生產(chǎn)加工過程中，為了增強食品的安全性，對牛乳進行加熱處理是最基本的操作步驟，特別是酸性凝膠如酸奶、干酪等的生產(chǎn)，加熱能增加牛乳的功能性并使產(chǎn)品達到合適的性質(zhì)，比如增加酸奶的黏度等［1］。酪蛋白主要是由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白四種單體組成，并通過磷酸鈣進行連接［2］，形成無數(shù)磷酸鈣包裹的單個酪蛋白分子的球狀微粒，平均直徑約為200nm，且微粒表面主要是由κ-酪蛋白單體形成延伸的毛發(fā)層，使整個微粒存在一定的空間和靜電平衡［3］。70℃以上溫度處理，能使乳清蛋白發(fā)生變性，自身發(fā)生聚集或與存在于酪蛋白表面的κ-酪蛋白結合，形成復雜的配合物［4］，而形成最多的是β-乳球蛋白/κ-酪蛋白復合物，但也有報道稱α-乳白蛋白的不可逆變性也提供一定的作用［5］。同時，維持酪蛋白分子膠束結構穩(wěn)定性的諸多作用力，疏水作用、氫鍵、二硫鍵等，在加熱處理時也發(fā)生改變，可能會進一步促進β-乳球蛋白與κ-酪蛋白的結合［6］。

牦牛乳是青藏高原特有的天然綠色食品，蛋白質(zhì)含量為5.60%，比荷斯坦牛乳高100.7%，而乳蛋白的組成以酪蛋白為主，含量約84%［7］。近幾年來，我國對牦牛乳的研究利用逐漸增多，主要集中于營養(yǎng)成分、功能性質(zhì)、產(chǎn)品加工等方面，對外界條件影響牦牛乳中酪蛋白的研究不多。因此，熱處理過程中，由于加熱溫度和時間的不同，導致牦牛脫脂乳中酪蛋白功能特性和膠束變化的研究，必將促進開發(fā)新的牦牛乳產(chǎn)品，為牦牛乳酪蛋白及其產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牦牛乳 甘肅天祝;疊氮化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、十二烷基磺酸鈉(SDS) 均為分析純;去離子水。

立式高速冷凍離心機(KR25i) 法國Jouan公司;分光光度計(722S) 上海精密科學儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋(HWS26) 上海一恒科技有限公司;雙光束紫外-可見分光光度計(UV-2100) 鄭州博邦科貿(mào)有限公司;熒光分光光度計(RF-5301PC)日本島津公司;激光光散射儀(BI-200SM) 美國Brookhaven儀器公司;均質(zhì)機;微量注射器;Whatman玻纖濾紙。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 新鮮牦牛乳用紗布過濾除雜后，在20℃、3500×g的條件下離心30min，去除上層脂肪。再用Whatman玻纖濾紙過濾三次以除去殘留的脂肪，得到的即為脫脂乳。最后加入0.02%(w/v)疊氮化鈉以防止微生物生長，并在4℃下儲存［8］。

1.2.2 不同溫度及時間熱處理 將上述脫脂乳在水浴鍋中恒溫加熱，溫度分別為30、40、50、60、70、80、90℃(牛乳溫度)，處理時間分別為5、10、15、20、25m in，將處理后樣品取出后在冷水中迅速冷卻至室溫，在4℃保存［9］。處理后樣品最多保存5d，在測定前將試樣在室溫下放置1h。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 熱穩(wěn)定性的測定［10］分別取熱處理后的樣品溶液20m L，稱取一定量的溶液于離心管中，在20℃，3920×g的條件下離心10m in，倒出上層溶液，稱取下層沉淀物重量，計算比較沉淀量與樣品溶液的比例，沉淀量越大，熱穩(wěn)定性越差。

1.2.3.2 乳化性的測定［11］取5m L菜籽油與15m L待測樣品溶液，在高速分散均質(zhì)機上均質(zhì)1m in，立即用微量注射器從乳狀液的底部取100μL，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS溶液稀釋至10m L，在500nm波長下測定吸光度值。將乳狀液靜置10min后再以同樣的方法稀釋并測定，得到的吸光值A1與初始值A0用來衡量乳化活力指數(shù)(EAI)與乳狀液穩(wěn)定性(ES)。

式中:EAI為每克蛋白質(zhì)的乳化面積(m2/g); C為溶液中樣品蛋白的濃度(g/m L);L為比色杯直徑1cm);A為500 nm處的吸光值;N為稀釋倍數(shù); Φ為油相所占的分數(shù);A0為零時刻的吸光值;A1為30m in后的吸光值。

1.2.3.3 濁度的測定［12］分別用微量移液器移取熱處理后樣品200μL，用去離子水稀釋至10m L，在室溫、633nm的波長條件下，用紫外-可見分光光度計測定樣品溶液的吸光度(A)，以去離子水為參比溶液，平行測定三次。

1.2.3.4 表面疏水性測定［13］分別用微量移液器移取熱處理后樣品100μL，用0.01mol/L、pH7.0的緩沖溶液稀釋至20m L，最后加入100μL ANS熒光劑，振蕩，靜置3min，在激發(fā)波長390nm、發(fā)射波長470nm的條件下測定熒光強度值。用熒光強度(I)來衡量溶液中蛋白的表面疏水性。

1.2.3.5 粒徑測定［14］分別用微量移液器移取熱處理后樣品100μL，用去離子水稀釋至10m L，使其達到儀器測量的濃度范圍，在激光器的波長為632.8 nm，散射角為90°的條件下進行掃描，測定粒徑分布及微粒強度。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗中所有數(shù)據(jù)均采用Excel統(tǒng)計、Orign8.0作圖，再運用SPSS17.0進行顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 熱穩(wěn)定性

加熱溫度的上升和時間的延長可引起蛋白質(zhì)間的化學鍵發(fā)生變化、相互反應以及空間構象的改變，相應會導致整個蛋白質(zhì)溶液體系穩(wěn)定性發(fā)生不同程度的變化。

沉淀率越大則熱穩(wěn)定性越差。由圖1可知，隨著溫度的上升，牦牛脫脂乳中沉淀量隨之增大，且在低于70℃時，總體變化不大，70～80℃急劇增加，80～90℃基本恒定;隨著加熱時間的延長，沉淀率總體也呈增大的趨勢，在30～70℃間加熱5、10min時總體緩慢增加，15～25m in基本恒定不變;單從增加的幅度來看，短時間(5、10m in)的加熱在較低溫度較大，在較高溫度(80～90℃)與較長時間熱處理基本一致。結果說明，不同溫度及時間的加熱處理，都能導致乳液系統(tǒng)的穩(wěn)定性下降，尤其是溫度70℃以上、大于10m in的處理時間，可使脫脂乳中存在的大量乳清蛋白變性程度顯著提高，與酪蛋白之間以新的化學鍵進行連接，導致彼此空間構象發(fā)生改變［15］。而加熱在破壞存在于脫脂乳系統(tǒng)中各成分間平衡的同時，更能破壞主要存在的酪蛋白之間的氫鍵、疏水作用等作用力，使之發(fā)生新的反應，但從結果可以看出，脫脂乳的沉淀率總體由約1.2%增至1.9%左右，也未造成明顯的大量絮集，因此30～90℃、25m in內(nèi)的加熱處理對牦牛脫脂乳的熱穩(wěn)定性影響不顯著(p＞0.05)。

圖1 不同溫度及時間熱處理后牦牛脫脂乳熱穩(wěn)定性的變化Fig.1 Difference of heat stability of the skim milk with the rise of temperature and time

2.2 乳化性

乳化性是指既能降低水和油的表面張力，又能降低水和空氣的表面張力的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的乳化性與疏水作用相關。研究中主要對乳化性中的兩個重要的指標(乳化活力指數(shù)EAI、乳化穩(wěn)定性ES進行了測定，見圖2。

圖2 不同溫度及時間熱處理后牦牛乳脫脂乳中蛋白乳化性的變化Fig.2 Difference of emulsifying of the skim milk with the rise of temperature and time

由圖2(a)可知，隨著加熱溫度的上升，脫脂乳中的蛋白EAI呈下降趨勢，在較低溫度(30～60℃)總體變化不明顯，但在較高溫度(60～90℃)減小幅度增大;加熱時間的延長也導致EAI改變，總體來看，15m in的加熱時間使得脫脂乳中蛋白質(zhì)有較高的EAI，但與其他時間差別不大(相差≤0.5m2/g)。說明隨著加熱溫度升高，脫脂乳中蛋白質(zhì)的疏水作用增強，主要是由于加熱時β-乳球蛋白變性程度增大，形成的β-乳球蛋白聚合體結合在酪蛋白膠束表面，導致其表面疏水性增加［16］，而酪蛋白在加熱時，內(nèi)部大量的疏水基在溫度的作用下也轉(zhuǎn)移至酪蛋白膠粒表面，使表面疏水性增加，EAI隨之降低。實驗結果也進一步表明加熱時間的增加也能促進所有反應的發(fā)生，但加熱超過15m in反而不利于反應的發(fā)生。

圖2(b)表示的是ES隨溫度和時間的變化。圖中可明顯觀察到，溫度的上升可使ES隨之降低，在30～50℃間基本不變，50℃以上時減小幅度顯著增大(p＜0.05)，當溫度上升到90℃時總體降至51%左右;在較低溫度(30～70℃)，加熱20、25m in對ES的影響較大，且短時間(5～15m in)加熱時整個溶液體系ES降低幅度較大。

2.3 濁度

濁度體現(xiàn)酪蛋白膠束的變化，能定性說明膠束間相互作用的改變。因為膠體懸浮液的濁度與膠體大小和微粒的散射特性相關，若粒子具有較大的尺寸和較高的散射系數(shù)，則體系的濁度較大。

由圖3可看出，隨著溫度的增加，脫脂乳的濁度呈上升的趨勢，在低于70℃時濁度以約10%的增長率緩慢增加，而在高于70℃以上時急劇增大，總體增長率約為30%，較高溫度的增幅明顯大于較低溫度;而加熱時間的延長同樣也導致濁度增大，加熱20、25m in時，脫脂乳的濁度在 30～80℃間顯著高于5～15m in，90℃時吸光度均在0.62±0.02左右，差異不顯著(p＞0.05)。這說明牦牛脫脂乳中存在的大量酪蛋白、乳清蛋白、乳糖等微粒，它們的尺寸和光散射系數(shù)都隨溫度的上升和時間的延長而變大、增強，從而導致濁度的增大。是因為溫度和加熱時間的增加都能促進大量的乳清蛋白、乳糖等與酪蛋白發(fā)生作用，以及原有存在的化學鍵斷裂與重組，都引起整個乳液系統(tǒng)濁度的改變［17］;其次，乳清蛋白在溫度70℃以上時，原有構造被破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)榈鸵患壍拇涡?，變性的乳清蛋白部分聚集在酪蛋白膠束表面，或與酪蛋白膠束表面結合形成復雜的配合物，致使樣品溶液中部分微粒的直徑顯著增大［18］;再次，溫度的增加及加熱時間的延長，也能引起酪蛋白膠束自身發(fā)生離解與聚集程度的增強，由研究結果可以看出，70℃以上的溫度可以更大程度的使酪蛋白自身聚集并與乳清蛋白發(fā)生反應，20、25min的加熱時間也是比較有利于聚集反應［19］;而且乳糖及微量元素在加熱時對與酪蛋白的相互作用起到一定的促進作用［20］。因此，諸多反應最終導致濁度大幅度增加，而加熱時間的延長也能使反應的程度增大。

圖3 不同溫度及時間熱處理后牦牛脫脂乳濁度的變化Fig.3 Difference of turbidity of the skim milk with the rise of temperature and time

2.4 表面疏水性

蛋白質(zhì)網(wǎng)絡的形成是由于蛋白質(zhì)中相鄰多肽鏈之間的吸引力與排斥力達到平衡時的結果，加熱使蛋白質(zhì)分子呈舒展狀態(tài)，原來包埋在卷曲內(nèi)部的疏水基團暴露在外面，從而使原來處于卷曲結構外部的親水基團相對減少。

由圖4可知，脫脂乳中蛋白質(zhì)的表面疏水性隨著溫度的上升逐漸增大，總體約由780增至945，而在較低溫度(30～60℃)變化不大，在較高溫度(60～90℃)顯著增加(p＜0.05);同時隨著加熱時間的延長，總體變化不是很明顯，但在50～60℃之間，可明顯觀察到，5、10min與15、20、25m in加熱處理時間的變化趨勢不同，前者呈持續(xù)增加的趨勢，后者則有略微下降。結果說明，加熱溫度和時間的不同可導致脫脂乳中酪蛋白表面疏水性發(fā)生變化，主要是因為加熱使乳清蛋白及酪蛋白等成分的親水基與疏水基的排列改變，尤其是包埋于酪蛋白膠束內(nèi)部的疏水基部分轉(zhuǎn)移至表面;且大量乳清蛋白變性，使通常包埋的容易反應的氨基酸側鏈基團暴露，特別是β-乳球蛋白的巰基反應增加，其中主要為二硫化物與變性乳清蛋白及酪蛋白表面的κ-酪蛋白發(fā)生的交換反應，導致乳蛋白中疏水基團之間的相互作用隨著溫度的增加而增強［21］。這更能說明上述乳蛋白EAI的變化，表面疏水性的增加說明疏水基團增多，親水基減少，油-水界面的作用力減弱，從而引起蛋白的EAI減小。但是加熱時間的延長對牦牛脫脂乳中蛋白表面疏水性影響不顯著(p＞0.05)，因此蛋白乳化性的降低不是完全依靠表面疏水性，也與其他作用有關，這有待于進一步進行驗證。

圖4 不同溫度及時間熱處理后牦牛脫脂乳中酪蛋白表面疏水性的變化Fig.4 Difference of surface hydrophobicity of the skim milk with the rise of temperature and time

2.5 粒徑

牦牛脫脂乳中的酪蛋白膠束微粒不是完全相同的，它存在一個比較寬的分布區(qū)間，而在加熱過程中，酪蛋白自身發(fā)生不同程度的離解與聚集，又與乳清蛋白、乳糖等發(fā)生作用，粒徑變化就更不能用一個固定的值來衡量，因此，在探討加熱時酪蛋白膠束大小的變化時，只能借助于平均粒徑來進行說明。光散射技術在研究高聚物的分子量及鏈構象中應用很廣泛，研究中所使用的動態(tài)光散射能得到粒徑分布、分子量分布、平移擴散系數(shù)等參數(shù)，可以用于研究蛋白質(zhì)的分子鏈構象、聚集體尺寸及形態(tài)等。

由圖5可以看出，在溫度30～90℃的加熱過程中，脫脂乳中酪蛋白膠束平均粒徑總體呈增大的趨勢，且在60℃以上顯著增大(p＜0.05);加熱時間延長時，酪蛋白膠束平均粒徑也隨之增大，20、25m in處理時尤為明顯，如在30℃，加熱時間25m in時比5～20m in的平均粒徑大20nm左右;70℃時，25m in的加熱處理也導致粒徑顯著增大，由 199.2nm增至268.1nm，隨后基本保持恒定。結果表明，加熱溫度和時間對脫脂乳中酪蛋白膠束大小影響比較大，70℃以上的溫度導致乳清蛋白的變性程度顯著增大，并大量粘附于酪蛋白膠束表面使膠束粒徑增大，加熱時間的延長也同樣使變性程度增大［22］。但在加熱處理時酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白單體發(fā)生解離，并隨溫度的升高而增大，剛開始緩慢，溫度越高、加熱時間越長解離程度越大［23］。但由實驗結果可知，在脫脂乳中，由于乳清蛋白的存在，加熱時乳清蛋白變性黏附在酪蛋白膠束表面的速度明顯大于酪蛋白自身的解離，使粒徑總體呈增大的趨勢。這與上述濁度的結果相對應，解離程度及粒徑的增大都能在一定程度導致牦牛脫脂乳樣品溶液中微粒數(shù)增多、增大，必然導致濁度的增大。

圖5 不同溫度及時間熱處理后牦牛脫脂乳中酪蛋白膠束平均粒徑的變化Fig.5 Difference of average particle size of the skim milk with the rise of temperature and time

3 結論

3.1 牦牛脫脂乳經(jīng)過不同溫度(30～90℃)及不同時間(5～25m in)的熱處理后，由于乳清蛋白變性及酪蛋白自身的離解、聚集作用，熱穩(wěn)定性、乳化性及濁度發(fā)生都改變。因此，隨著加熱溫度的上升、時間的延長，熱穩(wěn)定性下降，尤其在70℃、15m in以上劇減;乳化性也呈下降趨勢，但在加熱15m in時，在整個加熱溫度范圍內(nèi)EAI比其他加熱時間大;濁度總體呈增加趨勢，且70℃、15m in以上增幅較大。

3.2 脫脂乳中酪蛋白表面疏水性及平均粒徑都隨溫度的上升、時間的延長而增大，溫度越高、時間越長，變化越明顯。也進一步說明加熱時酪蛋白膠束的表面發(fā)生一定程度的變化，且乳清蛋白變性的程度比酪蛋白膠束自身離解速率更快，尤其是70℃以上。因此，熱處理時牦牛乳酪蛋白變化的研究，對探討牦牛乳在加工過程中酪蛋白的變化具有重要的指導意義。

［1］VASBINDER A J，ALTING A C，EDKIUIFCG.Quantification of the heat-induced casein-whey protein interactions inmilk and it relation to gelation kinetics［J］.Colloids and Surfaces B: Biointerfaces，2003，31:115-123.

［2］LITTLE EM，HOLT C.An equilibrium thermodynamic model of the sequestration of calcium phosphate by casein phosphopeptides［J］.European Biophysics Journalwith Biophysics Letters，2004，33:435-447.

［3］KARINE J，MARIE R，F(xiàn)ANNY G.Structure and surface propertie s of the serum heat-induced protein aggregates isolated from heated skim milk［J］.International Dairy Journal，2006，16: 303-315.

［4］LAURENCE D，MARCELA A，ANDDOUGLASG D.Acid gelation in heated and unheatedmilks:interactions between serum protein complexes and the surfaces of casein micelles［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55: 4160-4168.

［5］PAN X Y，MU M F.Micellization of casein-graft-dextran copolymer prepared through maillard reaction［J］.Wiley Periodicals，2006，81:29-38.

［6］ANEMA S G，LI Y.Further studies on the heat-induced pH-dependent dissociation of casein from the micelles in reconstituted skim milk［J］.Lebensmittel Wissenschaftund Technologie，2000，33:335-343.

［7］妥彥峰.甘肅天祝放牧白耗牛乳營養(yǎng)成分及脂肪酸研究［D］.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學，2006.

［8］PATRICA H，RISSO V M，RELLINGe M S，et al.Effect of size，proteic composition，and heat treatment on the colloidal stability of proteolyzed bovine casein micelles［J］.Colloid and Polymer Science，2007，285:809-817.

［9］ANEMA S G，HENNING K.Heat-induced，pH-dependent dissociation of casein micelles on heating reconstituted skim milk at temperatures below 100℃［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45:1108-1115.

［10］MENG G T，Ma C Y.Thermal properties of Phaseolus angularis(red bean)globulin［J］.Food Chemistry，2001，4(73): 453-460.

［11］JIANG S J，ZHAO X H.Transglutaminas einduced crosslinking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of themodified product［J］.International Dairy Journal，2011，21:198-205.

［12］CLAUDIA P，UWE S，SVEN R，et al.Crosslinking of casein bymicrobial transglutaminase and its resulting influence on the stability of micelle structure［J］.Journal of Biotechnology，2007，2:456-461.

［13］SAVA，VANDER P，CLAEYS，et al.The kinetics of heatinduced structural changes ofβ-LactoglobulinJournal［J］.Dairy Science Association，2005，88:1646-1653.

［14］ANEMA SG.Effect ofmilk concentration on heat-induced，pH- dependent dissociation of casein from micelles in reconstituted skim milk at temperatures between 20 and 120℃［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46: 2299-2305.

［15］CORREDIG M，DALGLEISH D G.The mechanisms of the heat-induced interaction ofwhey proteins with casein micelles in milk［J］.International Dairy Journal，1999，9:233-236.

［16］MOTTAR，BASSIER.Effect of heat-induced association of whey proteins and caseinmicelles on yogurt texture［J］.Journal of Dairy Science，1989，72(9):2247-2256.

［17］HASMUKH A，PATEL，HARJINDER S.Effects of Heat and high hydrostatic pressure treatments on disulfide bonding interchanges among the proteins in skim milk［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54:3409-3420.

［18］DALGLEISH D G，BANKS.The formation of complexes between serum proteins and fat globules during heating of whole milk［J］.Mischwissenschaft，1991，46:75-78.

［19］ANEMA SG.Heat and/or high-pressure treatment of skim milk:changes to the casein micelle size，whey proteins and the acid gelation properties of the milk［J］.International Journal of Dairy Technology，2008，61(3):245-254.

［20］YANG Y Q，NARENDRA R.Properties and potentialmedical applications of regenerated casein fibers crosslinked with citric acid［J］.International Journalof BiologicalMacromolecules，2012，51:37-44.

［21］KEENAN T W，PATTON S.The structure of milk: Implications for sampling and storage［J］.Handbook of Milk Composition，1995，5:42-50.

［22］BRENDAN T O，KENNED Y.Control of heat-induced aggregation ofwhey proteins using casein［J］.International Journal of Dairy Technology，2006，54:5637-5642.

［23］ANEMA SG.Role ofκ-Casein in association of denatured whey proteins with casein micelles in heated reconstituted skim milk［J］.International Journal of Dairy Technology，2007，55: 3635-3642.