楊青松，趙 艷，王 瑩，熊 勇，鄧芳軼

(1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500; 2.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，云南昆明650201; 4.云南省食品藥品檢驗(yàn)所化學(xué)室，云南昆明650011)

紅雪茶為地衣類梅衣科(Parmeliaceae)金絲屬(Lethariella(Mot.)Krog.)2種不同地衣的統(tǒng)稱，即金絲刷(L.cladoniioides)和金絲帶(L.zahlbruckneri)［1-2］。紅雪茶由于其地衣體為橘紅色至土紅色，開水沖泡后色澤紅亮，猶如紅葡萄酒色，故在滇西北又稱為鹿心雪茶?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紅雪茶具有清熱、抗炎、抗疲勞、抗輻射等作用［3-6］，具有鎮(zhèn)靜、消炎、止痛的功能［7］。據(jù)考證，少數(shù)民族，尤其是藏族將其作為茶飲具有悠久的歷史［1］，是一種天然、無污染、無毒副作用的野生飲品，具有較高的開發(fā)價(jià)值。植物源天然色素由于其色調(diào)自然、安全性高，同時(shí)大多數(shù)兼具營養(yǎng)和藥理作用，目前已逐漸替代人工合成色素［8-9］。對天然色素的開發(fā)和應(yīng)用成為行業(yè)熱點(diǎn)，而類胡蘿卜素以其特殊生理功能和藥理功能一直是研究的熱點(diǎn)［10-11］。紅雪茶色素是一種天然食用色素，可用于食品，醫(yī)藥等行業(yè)中［12］。為充分利用這一資源，本文基于響應(yīng)面分析法，建立合適的BBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，對丙酮提取紅雪茶類胡蘿卜素工藝在料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個因素上進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得其最佳提取工藝，為日后紅雪茶深加工等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅雪茶 2011年9月購自云南省香格里拉縣山原土特產(chǎn)品經(jīng)銷店;丙酮 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自行制備。

FA1204B電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DFT-100手提式小型植物試樣粉碎機(jī) 北京科思佳科技有限責(zé)任公司;1650F紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品類胡蘿卜素的提取 使用小型植物試樣粉碎機(jī)粉碎樣品，過100目篩，用丙酮浸提，過濾后，濾液濃縮，獲得類胡蘿卜素提取液。

1.2.2 樣品類胡蘿卜素含量的測定 浸提液過濾后，以丙酮為參比液，使用紫外可見分光光度計(jì)在最大吸收波長445nm，進(jìn)行比色法測定吸光值。

依照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《水果、蔬菜汁類胡蘿卜素全量的測定GB12291-90》計(jì)算提取液類胡蘿卜素含量:

其中:A為提取液在最大吸收波長下的吸光值; 20為換算系數(shù)。

再根據(jù)式(1)以式(2)計(jì)算類胡蘿卜素的實(shí)際含量:

其中:V為提取液樣品的體積(m L);F為提取液樣品在測定吸光值時(shí)的稀釋倍數(shù);M為紅雪茶樣品干粉質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選取料液比(g/m L)、提取溫度(℃)、提取時(shí)間(min)3個影響因素，考察這3個因素對類胡蘿卜素提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用 Design-Expert7.0軟件中的中心組合實(shí)驗(yàn)(Box-Behnken Design，BBD)原理，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)方案。選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，以紅雪茶類胡蘿卜素提取液的吸光值為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化其提取工藝條件。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平，見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對紅雪茶類胡蘿卜素得率的影響 稱取紅雪茶粉1.00g，分別設(shè)定料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7(g/m L)，在30℃條件下提取30min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels in the response surface analysis

圖1 料液比對類胡蘿卜素提取的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction of carotenoids

由圖1可知，隨著液體比例的增加，類胡蘿卜素的提取量先小幅度上升，當(dāng)料液比到達(dá)1∶3時(shí)，提取量達(dá)到最大。但隨液體比例持續(xù)增加，類胡蘿卜素的提取量逐漸呈現(xiàn)下降趨勢。因此選擇料液比1∶2、1∶3、1∶4作為紅雪茶類胡蘿卜素提取的響應(yīng)面分析料液比3水平。

2.1.2 提取時(shí)間對紅雪茶類胡蘿卜素得率的影響

稱取紅雪茶粉1.00g，提取時(shí)間分別設(shè)定為10、20、30、40、50、60m in，在料液比1∶3(g/m L)、溫度30℃條件下浸提，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對類胡蘿卜素提取的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction of carotenoids

由圖2可知，提取時(shí)間10～20m in，類胡蘿卜素的提取量變化不明顯;當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30m in時(shí)，提取量明顯增加，并達(dá)到最大值。隨著提取時(shí)間延長，類胡蘿卜素的提取量逐漸降低，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，丙酮揮發(fā)越明顯。因此，選擇20、30、40m in作為類胡蘿卜素的響應(yīng)面分析提取時(shí)間3水平。

2.1.3 提取溫度對紅雪茶類胡蘿卜素得率的影響 稱取紅雪茶粉1.00g，提取溫度分別設(shè)為25、35、45、55、65、75℃，在料液比1∶3(g/m L)條件下浸提30m in，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis for regression model

圖3 提取溫度對類胡蘿卜素提取的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of carotenoids

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，類胡蘿卜素的提取量有明顯的增加，當(dāng)溫度到達(dá)55℃時(shí)，提取量最大。提取溫度繼續(xù)增加，類胡蘿卜素的提取量有小幅度的降低，這可能是浸提溫度過高，導(dǎo)致溶劑揮發(fā)損失所致。因此，選擇45、55、65℃作為類胡蘿卜素提取的響應(yīng)面分析溫度3水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對紅雪茶類胡蘿卜素提取條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

運(yùn)用Design expert7.0軟件對實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

以紅雪茶類胡蘿卜素提取液的吸光值為響應(yīng)值，得到紅雪茶類胡蘿卜素對自變量X1(料液比)、X2(提取溫度)、X3(提取時(shí)間)的回歸方程:

表3中模型項(xiàng)p值為0.0002，該值小于0.01，說明該模型回歸極顯著，可用于紅雪茶類胡蘿卜素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9664與決定系數(shù)為R=0.9233相差不大，表明回歸方程的擬合度好，失擬小，可用該回歸方程優(yōu)化紅雪茶類胡蘿卜素的提取工藝。同時(shí)表3中的 p值表明，方程中X1X2、X2X3、X、X對類胡蘿卜素提取液的吸光值有極顯著影響。失擬項(xiàng)p值為0.2776，說明無顯著性影響，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)，模型適當(dāng)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面直觀分析 根據(jù)回歸方程，獲得料液比、提取溫度和提取時(shí)間兩兩相互作用對類胡蘿卜素提取量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 各兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface and contour plots of cross-interaction between each two factors

圖4a中響應(yīng)面的坡度很陡，可以得出料液比和提取溫度的交互影響對類胡蘿卜素的提取有顯著影響;溫度軸的等高線變化密集，料液比軸的等高線變化稀疏，所以料液比對響應(yīng)值峰值的影響較提取溫度大。圖4b中響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出提取時(shí)間和料液比的交互影響對類胡蘿卜素提取的影響不夠顯著，通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中料液比對響應(yīng)值的影響大于提取時(shí)間。圖4c中響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出提取溫度和提取時(shí)間的交互影響對類胡蘿卜素提取的影響不夠顯著，通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中提取溫度對響應(yīng)值的影響大于提取時(shí)間。故對紅雪茶類胡蘿卜素提取量的影響大小順序?yàn)榱弦罕?X1)＞提取溫度(X2)＞提取時(shí)間(X3)，其中料液比的影響極顯著。

通過Design-Expert 7.0軟件分析，可以獲得紅雪茶類胡蘿卜素的最佳條件是在料液比為1∶3.07，溫度51.45℃，提取時(shí)間20.00min時(shí)，紅雪茶類胡蘿卜素提取量的預(yù)測吸光值為0.3794，理論類胡蘿卜素提取量為23.295μg/g。采用最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際測得類胡蘿卜素提取條件為料液比1∶3，提取溫度52℃，提取時(shí)間20m in，紅雪茶類胡蘿卜素提取量的吸光值平均為 0.3682，類胡蘿卜素提取量達(dá)到22.092μg/g，實(shí)際值與理論值的相對誤差較小，說明該實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化后得到的紅雪茶類胡蘿卜素提取條件準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

類胡蘿卜素在自然界中廣泛存在，具有特殊的生理功能和藥理功能，對人類的健康非常重要。但由于人類自身無法合成類胡蘿卜素，所以類胡蘿卜素的制備顯得很重要。目前制備天然的類胡蘿卜素常用的方法有:有機(jī)溶劑提取法、酶反應(yīng)法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等［13］。其中后4種提取法都極大的提高了類胡蘿卜素提取率［14-17］，如張衛(wèi)強(qiáng)等［14］應(yīng)用微波輻射萃取番茄紅素，在最佳的工藝條件下，色素提取率為97.56%。熊犍等［15］采用超聲輻射提取玉米類胡蘿卜素，得到的類胡蘿卜素的濃度是無超聲輻射時(shí)的16.25倍。但酶反應(yīng)法和超臨界流體萃取法儀器裝置復(fù)雜，不利于推廣應(yīng)用。而微波輔助提取法和超聲波輔助提取法則是以有機(jī)溶劑提取法為基礎(chǔ)的。因此對常規(guī)有機(jī)溶劑提取法工藝優(yōu)化是提高類胡蘿卜素提取率的基礎(chǔ)。

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，基于常規(guī)有機(jī)溶劑提取法對紅雪茶類胡蘿卜素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后得到的紅雪茶類胡蘿卜素提取最佳工藝條件為:料液比1∶3(g/m L)、提取溫度52℃、提取時(shí)間20min，在該條件下類胡蘿卜素提取液的吸光值為0.3682，實(shí)際獲取紅雪茶類胡蘿卜素22.092μg/g，與預(yù)測值接近。該實(shí)驗(yàn)獲得的優(yōu)化提取條件，能有效提高紅雪茶類胡蘿卜素的提取量，為今后的開發(fā)利用提供一定的理論參考。

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