王文博 劉 東 張艷菊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑 龍江哈爾濱 150030）

近年來，黑龍江省西瓜種植面積穩(wěn)定在21.5 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量450 萬(wàn)t，總產(chǎn)值30 億元左右（王喜慶，2008）。隨著優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種的引進(jìn)，生產(chǎn)上出現(xiàn)一種新的病害，侵染初期，果皮上出現(xiàn)直徑幾毫米的水浸狀凹陷斑點(diǎn)，隨后迅速擴(kuò)展為直徑幾厘米不規(guī)則的大型病斑，發(fā)病中后期，果肉變成水浸狀，果皮龜裂，溢出粘稠、透明的琥珀色菌膿。該病害一旦發(fā)生難以控制，不但降低西瓜品質(zhì)，而且影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，果實(shí)只要發(fā)病就失去了商品價(jià)值，對(duì)黑龍江省西瓜生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，給瓜農(nóng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損 失。2010年筆者在發(fā)生上述癥狀的黑龍江省哈爾濱市和雙城市西瓜田采集病樣，進(jìn)行了病原菌的分離、鑒定，以期明確病害發(fā)生原因，為病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的采集及分離、純化

2010年7月在黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)、雙城市西瓜田采集發(fā)病果皮及種子，進(jìn)行分離檢測(cè)。在NA 培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行分離和純化（方中達(dá)，1997），30℃培養(yǎng)48～72 h。獲得純化培養(yǎng)的菌株4個(gè)。

1.2 病原菌的致病性測(cè)定

將獲得的菌株在30℃培養(yǎng)48 h，制成108cfu·mL-1的菌懸液，采用針刺法（金巖 等，2004）將配好的菌懸液接種到西瓜果實(shí)上，以接種清水為對(duì)照。28℃保濕72 h后觀察發(fā)病情況。出現(xiàn)病癥后，從病斑上再分離病菌，按柯赫氏法則進(jìn)行鑒定。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 病原菌的形態(tài)觀察及染色 對(duì)有致病性的菌株，用結(jié)晶紫草酸胺染色法（方中達(dá)，1997）進(jìn)行革蘭氏染色。采用透射電鏡的負(fù)染技術(shù)觀察病原菌的鞭毛著生位置及數(shù)目、菌體形態(tài)，測(cè)量菌體大小。

1.3.2 病原菌的生理生化性狀測(cè)定 各菌株在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，參照Schaad 等（2001）的方法對(duì)病原菌的耐鹽性、對(duì)碳源的利用等生理生化性狀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 細(xì)菌16S rDNA 序列分析 采用CATB 法提取待測(cè)細(xì)菌基因組DNA（Ausubelm et al.，1998）。以提取的DNA 為模板，采用細(xì)菌的16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（滕齊輝 等，2006）。引物序列為：上游引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物R：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系：2.0 μL dNTP（2 mmol·L-1），引物F（10 μmol·L-1）、引物R（10 μmol·L-1）各1 μL，1 μLTaq酶（1U·μL-1），2.5 μL Buffer（10×），2 μL MgCl2（25 mmol·L-1），雙蒸水14.5 μL，模板DNA 1 μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 50 s，55℃退火 45 s，72℃延伸110 s，循環(huán) 30次；72℃保持10 min，最后在4℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序部（北京）測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病癥狀

田間發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)在向陽(yáng)面的西瓜果實(shí)表面，發(fā)病初期在果皮上出現(xiàn)直徑幾毫米的暗綠色水漬狀凹陷斑點(diǎn)，后擴(kuò)展為不規(guī)則的直徑幾厘米的大型病斑，果肉變成水浸狀，果皮龜裂，常溢出粘稠、透明的琥珀色菌膿（圖1）。

2.2 病原菌致病性測(cè)定

從發(fā)病果實(shí)上分離得到4個(gè)菌株，經(jīng)致病性測(cè)定，H1（分離自哈爾濱市）和S1（分離自雙城市）2個(gè)菌株對(duì)西瓜果實(shí)有致病性，在果皮上形成大的暗綠色水漬狀病斑，最后果實(shí)腐爛，與田間發(fā)病癥狀一致。將接種后發(fā)病的果皮再次進(jìn)行分離培養(yǎng)及接種鑒定，得到與最初分離相同的原病菌及癥狀。說明這2個(gè)菌株均為致病菌。

圖1 田間發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)及染色反應(yīng) 具有致病性的2個(gè)菌株在NA 平板上30℃生長(zhǎng)1 d后均形成圓形、隆起、光滑、不透明的乳白色菌落，菌落直徑可達(dá)2～3 mm，無(wú)明顯色素產(chǎn)生。2個(gè)菌株革蘭氏染色反應(yīng)均為陰性，菌體呈短桿狀，直或稍彎，大小為（1～2）μm×（0.5～1.0）μm；鞭毛極生、單根，長(zhǎng)4～5 μm（圖2）。

圖2 病原菌的電鏡照片

2.3.2 生理生化性狀 供試H1 和S1 2個(gè)菌株的生理生化特性表現(xiàn)一致。生長(zhǎng)最適溫度為30℃，最低10℃，最高42℃，致死溫度為51℃15 min。在碳源利用方面，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和山梨醇，但不能利用D-木糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、麥芽糖、鼠李糖、肌醇、奎尼酸和甜菜堿。能使明膠液化，但不能產(chǎn)生果聚糖，不能產(chǎn)生吲哚，不能使淀粉水解，過氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陽(yáng)性，能利用吐溫80，MR 試驗(yàn)（甲基紅試驗(yàn)）和V-P試驗(yàn)（產(chǎn)生3-羥基丁酮試驗(yàn)）呈陰性，馬鈴薯軟腐試驗(yàn)呈陰性，3%耐鹽性試驗(yàn)呈陽(yáng)性（表1）。

表1 待測(cè)菌株生理生化測(cè)定結(jié)果

2.3.3 細(xì)菌16S rRNA 序列分析 用細(xì)菌16S rRNA 通用引物擴(kuò)增待測(cè)菌株H1 和S1 的16S rDNA，均得到1條1 400 bp 左右的條帶（圖3），擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將所得到的序列結(jié)果與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果表明，H1 與GenBank 中的燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎NAcidovorax avenaesubsp.citrulli（登錄號(hào)分別為FJ447560.1、FJ447558.1、FJ447559.1、AM850114.1）的同源性為100%，S1 菌株與上述幾個(gè)菌株和AF078761.1 的同源性為89%～99%（表2）。

圖3 菌株H1、S1 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表2 GenBank 中與供試菌株H1、S1 的16S rDNA 序列同源性最高的菌株

3 結(jié)論與討論

有關(guān)西瓜細(xì)菌性果斑病的報(bào)道多集中在國(guó)外，最早于1969年在美國(guó)弗羅里達(dá)州由Crall 和Schenck（1969）報(bào)道。1978年在《植物病害手冊(cè)》上描述了昆士蘭、澳大利亞發(fā)生的細(xì)菌性果斑病在果實(shí)上的典型癥狀并認(rèn)為其病原菌是假單胞菌（Pseudomonas）（Vock & Hampson，1978）。1988年Wall 和Santos（1988）報(bào)道在關(guān)島有西瓜細(xì)菌性果斑病的發(fā)生，并首次將其病原菌鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenessubsp.citrulli）。1989年該病在美國(guó)各州暴發(fā)，對(duì)西瓜造成嚴(yán)重危害后，Wall（1989）才把病瓜和病苗聯(lián)系起來，從而知道果斑病菌對(duì)幼苗和果實(shí)均能侵染。此后該病在土耳其、韓國(guó)等地相繼出現(xiàn)并有報(bào)道（Hopkins，1989；Jec，1990；Latin & Rane，1990；Evans & Mulrooney，1991；Jacobs et al.，1992；Black et al.，1994；Demir，1996；Hamm et al.，1997）。直到1992年Willems 等（1992）根據(jù)西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA 和DNA-DNA 分子雜交研究結(jié)果，將其更名為Aciuovorax avenaesubsp.citrulli。國(guó)內(nèi)1987年李明遠(yuǎn)（1987）報(bào)道了該病在北京的發(fā)生，張榮意等（1998）對(duì)在海南省樂東和東方兩縣采集的3個(gè)菌株進(jìn)行了鑒定，將其病原菌鑒定為Acidovorax avenasubsp.citrulli。許瑛玲等（2000）報(bào)道了1997年以來在臺(tái)灣的甜瓜種植區(qū)發(fā)生的細(xì)菌性果斑病，并將其病原鑒定為Acidovorax avenaesubsp.citrulli。張昕等（2001）報(bào)道了在新疆哈密瓜上發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax avenaesubsp.citrulli）。同年，趙廷昌等（2001）報(bào)道了在內(nèi)蒙古和新疆的哈密瓜上有細(xì)菌性果斑病的發(fā)生。金巖等（2004）在吉林、蔡學(xué)清等（2005）在福建、趙廷昌等（2009）在山東省壽光市和昌樂縣均發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了該病。

本試驗(yàn)對(duì)采自黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)和雙城市病瓜上的細(xì)菌進(jìn)行分離純化、致病性測(cè)定、形態(tài)觀察、染色反應(yīng)、生理生化測(cè)定和16S rDNA 的序列分析，確定在黑龍江省阿城、雙城地區(qū)西瓜上的病害為由Acidovorax avenaesubsp.citrulli引起的西瓜細(xì)菌性果斑病。本試驗(yàn)是首次報(bào)道黑龍江省西瓜細(xì)菌性果斑病的發(fā)生，對(duì)指導(dǎo)黑龍江省西瓜細(xì)菌性果斑病的檢疫和防治具有重要意義。

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