林 瑜 楊光參 王艷偉

(溫州大學物理與電子信息工程學院，溫州 325035)

(2012年12月19日收到;2013年2月2日收到修改稿)

1 引言

DNA作為一種生物大分子，與中性高分子和簡單電解質(zhì)相比，它是一種有著不同特性的聚電解質(zhì)[1,2].當溶解于極性溶劑時，DNA將離解成高帶電量的聚離子，且周圍布滿了許多小的平衡離子.由于DNA附近不同化合價的平衡離子分布不均勻，導致DNA的長程靜電相互作用和熵發(fā)生變化，從而改變DNA的構(gòu)型.

通常人們利用平衡離子凝聚理論[3,4]，蒙特卡洛模擬[5]或者通過解泊松-玻爾茲曼方程[6]來研究聚電解質(zhì)周圍的平衡離子分布，這些理論研究結(jié)果表明平衡離子在聚電解質(zhì)表面凝聚形成一種薄層結(jié)構(gòu).其中Manning的平衡離子凝聚理論通常用于描述在溶液中小離子與聚電解質(zhì)的非特異性結(jié)合.強帶電的線性聚電解質(zhì)將吸附它周圍的平衡離子，吸附的平衡離子中和了聚電解質(zhì)上的電荷.當溶液里只存在一種化合價為Z的平衡離子，根據(jù)Manning理論[2]可知聚電解質(zhì)上的電荷被中和的部分與原來的電荷之比θ可寫為

DNA是遺傳信息的載體，細胞中的DNA必須凝聚成特定結(jié)構(gòu)裝載到細胞核中.因此，DNA凝聚在人工基因轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)染過程[7,8]、基因治療[9,10]和基因重組[11,12]等方面有潛在的應用.從Manning的平衡離子凝聚理論可知，平衡離子能中和DNA上的大部分電荷，但DNA上還有部分未被中和的電荷，DNA分子之間還存在著靜電排斥力.如何克服這個剩余靜電排斥力，Shklovskii[13]研究小組提出了一種新的理論解釋.他們認為，由于強的橫向排斥效應，平衡離子在DNA表面形成了一種類似Wigner晶體結(jié)構(gòu)的強關(guān)聯(lián)流體結(jié)構(gòu).吸附在DNA表面的平衡離子屏蔽了DNA的電荷，從而使得DNA間的排斥力減小，當DNA之間的靜電排斥力小于靜電吸引力時，DNA發(fā)生凝聚.多價平衡離子在DNA表面形成的強關(guān)聯(lián)流體結(jié)構(gòu)使得平衡離子的結(jié)合能大于kBT，這導致了更多的平衡離子吸附在DNA表面.當多價平衡離子的濃度達到一個臨界值時，吸附在DNA表面的平衡離子的總電荷在絕對值上將大于DNA的電荷，使得DNA的凈電荷的符號發(fā)生了反轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象就叫做DNA的電荷反轉(zhuǎn).

在過去的幾十年里，有很多關(guān)于DNA和平衡離子相互作用的理論和實驗研究[14-16].如Vuleti等[1]利用熒光關(guān)聯(lián)光譜(FCS)和介電光譜研究了在非常低的單價鹽濃度(csalt＜0.05 mM，1 M=1 mol/L)的水溶液中棒狀聚電解質(zhì)上的有效電荷.他們驗證了Manning的凝聚和電導模型適用于描述處于稀溶液中的棒狀聚電解質(zhì).Ma等[17]通過凝膠電泳實驗測量了DNA(1000—5000 bp)在不同結(jié)構(gòu)和不同化合價的平衡離子的溶液情況下的有效電荷.他們的實驗結(jié)果與兩種平衡離子共存的理論結(jié)果相符合.Besteman等[18]利用動態(tài)光散射(DLS)和磁鑷技術(shù)研究了多價平衡離子導致DNA發(fā)生電荷反轉(zhuǎn).實驗結(jié)果表明對于四價平衡離子，DNA的電泳遷移率隨著平衡離子濃度的增大由負變?yōu)檎?，即DNA的電荷發(fā)生反轉(zhuǎn).而對于三價平衡離子，DNA的電泳遷移率隨著離子濃度的增大逐漸減小但始終為負.在理論上，Luan等[19]通過分子動力學模擬研究了平衡離子導致的DNA電荷反轉(zhuǎn).他們發(fā)現(xiàn)對于三價或者四價平衡離子，隨著平衡離子濃度的增大，DNA的遷移率發(fā)生反轉(zhuǎn).但是對于單價或者二價平衡離子，隨著平衡離子濃度的增大，DNA的遷移率逐漸減小但不會反轉(zhuǎn).

然而，對于自由溶液中DNA的電泳遷移率與不同化合價的平衡離子之間的關(guān)系還沒有系統(tǒng)的實驗研究.本文利用DLS技術(shù)系統(tǒng)地研究了DNA的電泳遷移率與平衡離子(化合價1—4)濃度的關(guān)系.同時，利用原子力顯微鏡(AFM)研究了DNA分子構(gòu)型隨不同化合價平衡離子的變化.

2 實驗過程

2.1 實驗材料

實驗選用的噬菌體λ-DNA(原始濃度是500 ng/μL)購買于 New England Biolabs公司，使用前無需提純.實驗選用的單價和二價平衡離子分別為NaCl和MgCl2，二者均購買于Inalco-America公司.純水(18.2 MΩ·cm)是經(jīng)密理博超純化系統(tǒng)去離子與凈化處理.多價離子三氯六氨絡合鈷([Co(NH3)6]3+)和精胺([C10N4H30]4+)購買于Sigma公司.

2.2 DLS實驗的樣品制備

動態(tài)光散射儀器采用Malvern公司的Zetasizer NanoZS設(shè)備，光源是氦氖氣體激光(λ=633 nm)，探測角為90°，利用M3-PALS技術(shù)測量電泳遷移率.實驗中所需的緩沖液為Tris溶液(10 mM Tris，pH=8.0)，用該緩沖液配制不同濃度的平衡離子溶液.在不同濃度的平衡離子溶液中加入DNA，使得DNA的最終濃度為1 ng/μL.混合液在室溫條件下培育10 min，然后取1 mL的混合液注入Zeta電位毛細管樣品池，置于動態(tài)光散射的樣品槽中進行測量.

2.3 AFM實驗的樣品制備與掃描

實驗儀器選用日本島津的SPM-9600原子力顯微鏡，工作模式為輕敲模式.實驗中采用1 Hz的掃描速度采集圖像，圖像像素是512×512.通過AFM本身的off-line軟件分析DNA圖像的高度、寬度等信息.將云母片切成1 cm×1 cm，新解離即用.實驗所用的緩沖液為1×TE溶液(10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0)，用該緩沖液配制不同濃度的平衡離子與DNA的混合溶液，其中DNA的濃度為1 ng/μL.混合液在室溫條件下培育10 min，然后用移液器取20μL的混合液滴在新解離的云母表面，室溫培育5 min后，每次用20μL的超純水沖洗，共沖洗10—15次，去除云母表面未吸附的DNA分子和雜質(zhì)，接著用氮氣吹干，放于干燥箱1—2 h后掃描.所有的實驗結(jié)果至少重復三次，確保實驗結(jié)果的準確性.

3 結(jié)果與討論

3.1 單價和二價平衡離子與DNA的相互作用

DNA可看成一種線性的強帶電的聚電解質(zhì)，且每個磷酸根基團都帶有一個單位的負電荷，當溶于極性溶劑中，平衡離子將在DNA周圍凝聚成一個薄層.根據(jù)Stern(斯特恩)模型，這個薄層應該分成兩個部分：第一部分包括吸附在表面的一層離子，形成了一個內(nèi)部緊密的雙電層，稱為Stern層;第二部分為Gouy-Chapman擴散層.按照Stern模型，DNA分子在運動時，應該與Stern層不可分離，似乎切動面就是Stern面.但是由于固體表面吸附的離子仍然保持者溶劑化(至少在擴散層的一側(cè))，故DNA分子運動除了與吸附的平衡離子一起外，還會帶著一薄層溶劑化的液體，因此實際運動的切動面應該在Stern面的更右側(cè)一點，這個切動面上的電勢就稱為ζ(Zeta)電勢或動電勢.

當溶液處于電場中，在外加電場的作用下，DNA分子向著與自己的電荷相反的電極方向遷移，而平衡離子與之作相對運動，這種現(xiàn)象稱為電泳.DNA的電泳遷移率μ由下式給出：

其中ζ為Zeta電勢，ε為溶劑的介電常數(shù)，η為溶劑的黏度系數(shù)，f(kr)為Henry函數(shù).通過DLS實驗我們可以直接測量DNA分子的Zeta電位，如圖1所示，利用(2)式可以得到DNA的電泳遷移率.

在外加電場的作用下，假設(shè)DNA分子的電泳遷移率只與DNA上的有效電荷有關(guān)[17]，則根據(jù)Manning的平衡離子凝聚理論可得緩沖液中只包含單價平衡離子(下標a)時的電泳遷移率與緩沖液中只包含Z價平衡離子(下標z)時的電泳遷移率之比為

本文利用DLS技術(shù)分別測量了在緩沖液中只包含平衡離子Na+或Mg2+的情況下DNA的電泳遷移率隨平衡離子濃度的變化，如圖2所示.從圖2中可以發(fā)現(xiàn)當平衡離子的濃度c＜5 mM時，DNA的電泳遷移率隨著平衡離子濃度的增大而逐漸減小，且平衡離子的化合價越大，DNA的電泳遷移率減小得越快.當c≥5 mM時，DNA的電泳遷移率逐漸趨于穩(wěn)定，且DNA分子的電泳遷移率μ1：μ2≈ 2：1，即緩沖液中只包含 Na+或 Mg2+時的電泳遷移率之比約為2：1，實驗所得結(jié)果與Manning的理論值相符合.對于單價或者低濃度的二價的平衡離子，它們只是中和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上的磷酸根基團所帶的負電荷，而無法使DNA發(fā)生凝聚.通過AFM實驗觀察到，在低濃度的二價平衡離子的條件下DNA在溶液中是以自由舒展的形態(tài)存在，如圖4(a)所示.正是由于低濃度的二價離子無法導致DNA凝聚，所以二價平衡離子常用于DNA分子的AFM成像.

圖1 DNA的Zeta電位分布圖

圖2 DNA的電泳遷移率隨平衡離子濃度的變化(NaCl用黑色方塊線表示，MgCl2用紅色圓點線表示，DNA的濃度為1 ng/μL)

3.2 三價平衡離子與DNA的相互作用

眾所周知，多價陽離子能導致DNA的形態(tài)發(fā)生變化.由于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上帶負電荷的磷酸根基團之間的靜電排斥作用，DNA在溶液中是以自由舒展的形式存在.而這些多價陽離子能中和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上的磷酸根基團所帶的負電荷，從而使磷酸根基團間的靜電排斥力減小，導致DNA的形態(tài)發(fā)生改變.當多價陽離子的濃度大于臨界值時，DNA分子將凝聚成特定的緊密結(jié)構(gòu).本文通過DLS實驗研究了DNA的電泳遷移率與三價平衡離子[Co(NH3)6]3+濃度的變化關(guān)系.

圖3 DNA的電泳遷移率隨平衡離子濃度的變化(NaCl用黑色方塊線表示，[Co(NH3)6]3+用紅色圓點線表示，DNA的濃度為 1 ng/μL)

當DNA溶液中加入三價離子，這些三價離子結(jié)合在磷酸根基團和氮基位點上使得DNA上的負電荷大部分被中和[21].通過觀察AFM圖像，可知[Co(NH3)6]3+可使DNA分子發(fā)生凝聚，凝聚結(jié)構(gòu)為花狀結(jié)構(gòu)，如圖4(b)所示.根據(jù)文獻[22]可知，當平衡離子的化合價Z≥3時，DNA發(fā)生凝聚，這表明多價離子的化合價越高，越容易使DNA發(fā)生凝聚[22].在溶液中多價離子導致DNA凝聚，此時的DNA電泳遷移率不僅與DNA上的有效電荷有關(guān)，而且可能與DNA的結(jié)構(gòu)有關(guān).由于在理論上我們假設(shè)DNA的遷移率只與它的有效電荷有關(guān)，而不考慮DNA的結(jié)構(gòu)的變化，所以我們得出的實驗結(jié)果與理論數(shù)據(jù)有明顯偏離.

圖4 (a)MgCl2成像DNA的AFM圖像;(b)[Co(NH3)6]3+導致DNA凝聚的AFM圖像，DNA，MgCl2和[Co(NH3)6]3+的濃度分別為 1 ng/μL，3.5 mM，和50μM

3.3 DNA的電荷反轉(zhuǎn)

在水溶液中，一個帶電的粒子(高分子)結(jié)合足夠多的平衡離子，使得其凈電荷的符號發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這個現(xiàn)象稱為電荷反轉(zhuǎn).在實驗中采用精胺([C10N4H30]4+)作為四價的平衡離子，隨著精胺濃度的增大，由于電荷中和作用DNA的電泳遷移率逐漸減小，如圖5所示.當平衡離子濃度等于1 mM時，DNA 的電泳遷移率 μ1：μ4≈ 5：1，即緩沖液中只包含單價離子或四價離子時DNA的遷移率之比是5：1.根據(jù)Manning的凝聚理論，DNA的電泳遷移率 μ1：μ4應為 4：1，顯然理論值與實驗結(jié)果有明顯偏離.可能的原因是DNA在四價平衡離子的作用下發(fā)生了凝聚，而理論計算并沒有考慮DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化所帶來的影響.從圖5中可以發(fā)現(xiàn)當精胺的濃度為5 mM時，DNA的電泳遷移率由負變正.隨著精胺濃度的增大，越來越多的平衡離子結(jié)合到DNA的表面，當結(jié)合在DNA表面的四價平衡離子的總電荷大于裸DNA的電荷的絕對值，此時DNA-[C10N4H30]4+復合物的凈電荷由負變?yōu)檎?，DNA發(fā)生電荷反轉(zhuǎn).然而，Manning的平衡離子凝聚理論無法解釋DNA的電荷反轉(zhuǎn)現(xiàn)象.

圖5 DNA的電泳遷移率隨平衡離子濃度的變化(NaCl用黑色方塊線表示，精胺(spermine)用紅色圓點線表示，DNA的濃度為 1 ng/μL)

4 結(jié)論

本文系統(tǒng)地研究了不同化合價的平衡離子與DNA之間的相互作用.動態(tài)光散射的實驗結(jié)果表明當溶液中只存在單價平衡離子或者二價平衡離子時，其實驗結(jié)果與Manning的平衡離子凝聚理論結(jié)果相符合.當溶液中的平衡離子的化合價Z≥3時，DNA發(fā)生凝聚，此時DNA的電泳遷移率不僅與DNA上的有效電荷有關(guān)，還可能與DNA的結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以測得的實驗結(jié)果大于理論值.當平衡離子的化合價Z=4時，DNA的電荷發(fā)生反轉(zhuǎn)，這主要是由于吸附在DNA表面的多價離子的總電荷大于裸DNA的電荷的絕對值.因此，對于一般情形，自由溶液中的聚電解質(zhì)的構(gòu)型和離子關(guān)聯(lián)效應與聚電解質(zhì)遷移過程密切相關(guān).關(guān)于電荷反轉(zhuǎn)部分的詳細研究正在進行中.

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