李秀景，尹儉儉，鄭叢龍

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 大連116622)

流感病毒能夠引起個體的嚴(yán)重感染甚至導(dǎo)致死亡，對人類的健康造成威脅。流感病毒曾多次引起全球流感大流行，每次流行都造成了嚴(yán)重的人力和物力的損失［1-2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道:每年流感全球流行可引起300 萬至500 萬人發(fā)病，導(dǎo)致2萬～5 萬人死亡［3］，受到流感感染的人口約20% ～40%，且流感導(dǎo)致的死亡率也在增加［4］。2009年3月在墨西哥暴發(fā)的甲型H1N1 流感，傳播迅速，世界衛(wèi)生組織于2009年6月11日便將全球流感疫情警戒等級提高到了第6 級，雖然流感病毒H1N1 的致病性低，但仍對全球的經(jīng)濟造成了嚴(yán)重的損失。

目前，臨床上常用的流感治療方法是藥物治療，但由于單鏈RNA 病毒缺乏自我校正的機制，在藥物的作用下，其突變頻率會明顯增高［5］，對藥物產(chǎn)生耐藥性，2008 -2009年在美國幾乎100%的季節(jié)性H1N1 病毒對奧司他韋具有了耐藥性，以及幾乎所有的H3N2 病毒對金剛烷胺也產(chǎn)生了耐藥性［6］。因此，研發(fā)安全有效的非特異的抗流感的藥物或材料具有重要意義。本論文旨在通過鼻腔給藥的方式，探討納米銀在小鼠體內(nèi)是否對流感病毒H1N1 感染有治療作用，為納米銀治療和預(yù)防流感病毒感染提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

清潔級昆明小鼠，體重18 ～22 g，雌雄各半，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2008 -0002］。流感病毒A/PR/8/34 H1N1(簡稱PR8 H1N1)，血凝滴度為1∶2048，購自中科院武漢病毒研究所，經(jīng)本實驗室接種后凍存。納米銀溶液為本實驗室研制，濃度為400 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立:選擇18 ～22 g 健康小鼠48 只，將其隨機分成6 組:正常對照組、治療陽性對照組、模型組、高劑量組(納米銀400 μg/mL)、中劑量組(納米銀100 μg/mL)和低劑量組(納米銀25 μg/mL)，每組8 只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。

將實驗小鼠經(jīng)乙醚麻醉，當(dāng)小鼠進入麻醉狀態(tài)且用鼻呼吸急促時，迅速進行滴鼻。正常對照組麻醉后滴鼻25 μL 生理鹽水，模型組、治療陽性對照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組麻醉后滴鼻25 μL H1N1 病毒液。滴病毒液4 h 后進行治療:模型組和正常對照組滴生理鹽水30 μL，高劑量組、中劑量組和低劑量組滴相應(yīng)濃度納米銀30 μL，治療陽性對照組小鼠灌胃達菲20 mg/kg，至此為第1 次治療。此后每隔24 h 進行1 次治療，治療總計3 次。

1.2.2 小鼠的一般生理指標(biāo):滴病毒之日記為第1天，連續(xù)觀察14 d。每天稱量小鼠體重，觀察并記錄小鼠的一般生理指標(biāo)包括小鼠的活動情況、毛色、飲水與飲食等。

1.2.3 死亡率和生存天數(shù):自滴病毒之日起，連續(xù)觀察14 d，記錄各組小鼠的生存天數(shù)，第14 天仍存活的小鼠，頸椎脫臼處死，其生存天數(shù)記錄為14 d，數(shù)據(jù)整理，計算出各組小鼠的死亡率、平均生存天數(shù)和生命延長率，并繪制出各組的生存曲線。

1.2.4 肺指數(shù):肺指數(shù)常被用來表示腳部炎性病變的嚴(yán)重程度，肺指數(shù)越大，肺部炎性病變程度越嚴(yán)重。小鼠滴病毒后，實時觀察小鼠情況，小鼠死亡后稱取死亡時小鼠體重，立即無菌解剖取肺用分析天平稱量小鼠肺重;實驗第14 天，未死亡的小鼠頸椎脫臼處死，無菌解剖取肺稱重;計算各組小鼠的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率，其計算公式:

1.2.5 肺病毒滴度的測定:將無菌取得的肺組織，用無菌研磨器充分研磨后，用無菌PBS 稀釋肺組織研磨液，其稀釋比例為肺重:PBS =1 kg:2 mL，將獲得的稀釋液在4 ℃離心機3000 rmp 離心15 min。通過血凝試驗測定肺病毒的滴度。

1.2.6 肺組織病理學(xué)檢查:將無菌取得的鼠肺用10%甲醛固定，洗滌，脫水，透明，浸蠟與包埋，切片，貼片與烤片，切片脫蠟及水化，染色:蘇木精(Hematoxylin)和伊紅(Eosin)染色法簡稱HE 染色，切片脫水、透明與封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各實驗組肺組織與正常肺組織相比，其病理學(xué)變化。

1.2.7 肺組織細菌的感染情況:將無菌取得的肺組織，用無菌研磨器充分研磨后，用無菌PBS 稀釋肺組織研磨液，其稀釋比例為肺重:PBS =1 kg:2 mL，吸取混勻的研磨稀釋液50 μL 均勻涂布于血平板上，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，計數(shù)每個血平板上的菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用平均值()或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異比較用t 檢驗或單因素方差分析或非參數(shù)檢驗。P ＜0.05 為差異有顯著性意義，P ＜0.01 為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般生理狀況

正常對照組小鼠毛發(fā)光滑，活動敏捷，飲水、進食正常，體重持續(xù)增加;模型組小鼠滴病毒后第5天，活動減少，反應(yīng)遲鈍，毛色不光澤，開始出現(xiàn)戰(zhàn)栗，飲食和飲水驟減，體重減輕，第6 天小鼠慫毛，脫毛，弓背，走路搖擺，呼吸急促并開始死亡，體重與正常對照組小鼠比較明顯有差異;低劑量組和中劑量組在滴病毒5 天時，與正常對照組比較，活動減少，毛色略顯暗淡，體重減輕或未改變，與模型組比較，癥狀較輕，未出現(xiàn)戰(zhàn)栗，在第10 天時，這兩組大部分小鼠活動開始增加，體重開始增加，飲食飲水開始增加;高劑量組和治療陽性對照組小鼠在滴病毒5 天時，與正常對照組比較，活動略少，毛色變化不大，體重不變或減輕，在第8 天時，其大部分小鼠體重開始出現(xiàn)增加的趨勢，活動增多，飲食飲水開始增加。

2.2 死亡率和生存天數(shù)

模型組14 天內(nèi)的死亡率為100%，其實驗小鼠第6 天開始死亡并于第6、7、8 三天集中死亡，其平均生存天數(shù)為7.13 d;治療陽性對照組的死亡率為12.5%，其實驗小鼠的平均生存天數(shù)為13.75 d，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01，其生命延長率為92.85%;高劑量組死亡率為0，其實驗小鼠平均生存天數(shù)為14 d，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01，其生命延長率為96.35%;中劑量組死亡率為12. 5%，其實驗小鼠平均生存天數(shù)為13.13 d，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01，其生命延長率為84.15%;低劑量組死亡率為37.5%，其實驗小鼠平均生存天數(shù)為12.22 d，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01，其生命延長率為71.39%，見圖1。

圖1 生存曲線Fig 1 Survivorship curve

2.3 肺指數(shù)

用H1N1 病毒感染后，模型組小鼠的肺臟重量明顯增加，肺指數(shù)明顯增高，與正常對照組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01;感染病毒4 h 后給予不同濃度的納米銀和達菲治療，連續(xù)治療3 d，治療陽性對照組、高劑量組和中劑量組的肺指數(shù)均有所降低，且3 組分別與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0. 01，這3 組的肺指數(shù)抑制率分別為87.40%、90.55%、74.41%;低劑量組與模型組比較，差異無顯著性意義，P ＞0.05。各組肺指數(shù)均值見表1。

表1 肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率Tab 1 Lung index and lung index inhibition rate

2.4 肺病毒滴度

模型組75%小鼠的肺組織病毒滴度為1∶512，25%的小鼠高達1∶1024;治療陽性對照組75%小鼠的肺組織病毒滴度為＜1∶2，12.5%為1∶4，12.5%為1∶8，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01;高劑量組小鼠的肺組織病毒滴度均為＜1∶2，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01;中劑量組75%小鼠的肺組織病毒滴度為＜1 ∶2，12.5% 為1 ∶4，12.5%為1∶8，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01;低劑量組50%小鼠的肺組織病毒滴度為＜1∶2，37.5%為1∶8，12.5%為1∶4，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01。

2.5 肺組織病理學(xué)檢查

無菌剖取鼠肺，正常對照組鼠肺呈粉紅色，體積較小;模型組鼠肺充血水腫，呈暗紅色，體積增大;治療陽性對照組鼠肺顏色比正常鼠肺淺，部分部位充血，體積大小比正常鼠肺大，比模型組小;高劑量組鼠肺顏色與正常鼠肺相近，但部分部位有充血現(xiàn)象，體積大小與正常鼠肺相近。中劑量組和低劑量組鼠肺的左肺1/3 ～1/2 有充血現(xiàn)象，且低劑量組比中劑量組充血現(xiàn)象嚴(yán)重，體積大小比正常鼠肺大。光學(xué)顯微鏡下觀察(見圖2)，正常對照組小鼠肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小均一，肺泡壁厚度正常，外周未見有炎性細胞浸潤;模型組小鼠肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)消失，肺泡壁增厚，組織間可見大量紅細胞，肺泡間隔的毛細血管擴張、淤血，肺泡腔縮小，且肺泡腔見水腫液;治療陽性對照組肺組織病變比模型組減輕，可見部分肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于完整，肺泡壁比模型組薄但仍然比正常鼠肺厚;高劑量組小鼠肺組織的病變明顯減輕，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，但仍見肺部瘀血現(xiàn)象，肺泡壁明顯薄于模型組，肺泡壁肺泡腔中無水腫液。中劑量組肺組織病變比模型組輕，肺部淤血，只有部分肺泡腔完整，其肺泡壁比高劑量組厚;低劑量組只有少部分肺泡腔完整但肺泡腔減小，瘀血現(xiàn)象比較嚴(yán)重。

2.6 肺組織細菌的感染情況

圖2 肺組織病理檢查(×200)Fig 2 Lung histopathological examination (×200)

將研磨稀釋液50 μL 均勻涂布于血平板，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h 后，在平板上觀察到兩種不同的菌落:一種含量較多為白色不透明，表面光滑，直徑2 ～3 mm，經(jīng)革蘭染色為革蘭陽性球菌，觸酶試驗為陽性，判斷為葡萄菌屬;將該種菌接種至BIO -KONT Rap. S -16 葡萄球菌及微球菌鑒定試驗條中，用BIO-KONT 鑒定軟件分析知該細菌為木糖葡萄球菌，其鑒定概率為99.97%。另一種相對少為溶血性細菌，黃色不透明，直徑約為1 mm，經(jīng)革蘭染色為革蘭陽性球菌，觸酶試驗為弱陽性，判斷為葡萄菌屬;將該種菌接種至BIO -KONT Rap. S -16葡萄球菌及微球菌鑒定試驗條中，用BIO - KONT鑒定軟件分析知該細菌為溶血葡萄球菌，其鑒定概率為99.96%。模型組的平板上可見木糖葡萄球菌和溶血葡萄球菌兩種細菌，其菌落總數(shù)為4197.02 cfu/肺。高劑量組和中劑量組的平板上僅見木糖葡萄球菌，其菌落數(shù)分別為426. 63 cfu/肺、635. 43 cfu/肺，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01。治療陽性對照組和低劑量組的平板上可見木糖葡萄球菌和溶血葡萄球菌兩種細菌，其菌落數(shù)分別為1335.77 cfu/肺、1638.03 cfu/肺，與模型組相比差異有顯著性意義，P ＜0.01。

3 討 論

本次實驗研究結(jié)果顯示:經(jīng)納米銀治療后，小鼠的死亡率降低，生存時間延長，肺指數(shù)降低，肺組織病變減輕，說明納米銀對小鼠流感有治療作用;納米銀治療后，小鼠肺組織病毒滴度降低，肺組織細菌感染情況減輕，說明納米銀在抗病毒的同時也對細菌有抑制作用。

病毒感染細胞的全過程包括:病毒對細胞的吸附和侵入、脫殼、病毒遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、子代病毒顆粒的組裝、出芽和釋放。病毒繁殖的每個環(huán)節(jié)都有可能成為抗病毒藥物的作用靶點，通過干擾其中的一個或多個環(huán)節(jié)可阻斷病毒的復(fù)制和繁殖。在病毒感染和復(fù)制的過程中，血凝素(Hemagglutinin，HA)蛋白和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)起著重要的作用［7］。本課題組曾研究［8］:納米銀處理流感病毒后，病毒的血凝滴度明顯降低;納米銀對流感病毒NA 活性的抑制率均高于50%，能夠有效地抑制NA 的活性，從而阻斷病毒對細胞的感染。本次實驗證實納米銀能夠治療小鼠流感，故推測納米銀對流感病毒的作用機制可能是納米銀結(jié)合病毒表面的HA 空間保守結(jié)構(gòu)，從而影響病毒表面蛋白與上皮細胞HA 受體的識別;也可能是納米銀結(jié)合和破壞NA，或封閉上皮細胞上的NA 受體，抑制子代病毒體的成熟或干擾成熟的病毒體的釋放，從而阻斷病毒對細胞的感染。

本實驗通過鼻腔給藥的方法進行探討，其治療作用除與納米銀對流感病毒直接作用外，可能還與小鼠本身的免疫反應(yīng)尤其是黏膜免疫有關(guān)。流感病毒入侵機體的主要門戶是呼吸道黏膜，其具有黏膜免疫作用，因此呼吸道黏膜是機體防御的重要屏障。有報道稱，呼吸道上皮細胞與多種呼吸道疾病有密切的關(guān)系［9］。覆蓋著一層假復(fù)層纖毛柱狀上皮細胞，纖毛不停地擺動，具有機械的屏障作用，且呼吸道黏膜上皮地杯狀細胞和粘液腺的上皮細胞能分泌粘液，當(dāng)病毒感染機體時，纖毛活動和分泌粘液可以阻擋病毒對機體的感染;呼吸道黏膜部位有游走的或固定的吞噬細胞，其能夠吞噬病毒，減少病毒對機體的感染;黏膜下層有豐富的淋巴網(wǎng)，能夠阻留和破壞病毒;正常人的呼吸道黏膜上皮細胞由于接受某些病毒的隱性感染，常含有一定量的干擾素，可對病毒發(fā)生干擾作用。納米銀對流感病毒的直接作用和小鼠的黏膜免疫作用，使得納米銀對小鼠流感有治療作用。

但是流感病毒一旦感染細胞，就會分泌一些有利于病原體繁殖的蛋白酶和細胞因子，對呼吸道黏膜產(chǎn)生破壞，容易繼發(fā)細菌感染［10］。有研究顯示，流感病毒感染后容易引起細菌感染如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等［11-14］;細菌感染后能夠促進流感病毒的感染，如金黃色葡萄球菌具有的細菌性蛋白酶能夠促進流感病毒表面的HA 開裂，從而促進病毒的活化和復(fù)制，增強其感染性和致病力［15-16］，增加了流感病毒感染后的病死率［17-18］。對于流感病毒感染繼發(fā)細菌感染，大家認為出現(xiàn)細菌性肺炎后病毒的感染就基本結(jié)束，只進行抗菌感染忽視了抗病毒的治療，使流感的病死率增加;有研究發(fā)現(xiàn)小鼠感染流感病毒第5 天用奧司他韋治療，可明顯減輕流感病毒肺炎的并發(fā)癥并降低其病死率［19］。本實驗對小鼠肺組織病毒滴度和細菌感染情況進行了研究，結(jié)果顯示，經(jīng)納米銀治療后小鼠肺組織病毒滴度降低，細菌感染情況減輕，說明納米銀具有抗病毒和抗菌的雙重作用，從而降低實驗小鼠的死亡率。

目前臨床上常用的抗流感病毒藥物有兩種，干擾病毒M2 蛋白功能的藥物即離子通道抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)，以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。金剛烷胺和金剛乙胺作用靶點為M2 蛋白四聚體形成的離子通道，通過阻礙H+流向病毒粒子內(nèi)部，使病毒粒子內(nèi)部pH 值居高不下，從而阻礙病毒HA 構(gòu)象的改變，使HA1 和HA2 不能分離，阻礙了病毒膜和內(nèi)體膜的融合，使病毒脫衣殼受阻。奧司他韋和扎那米韋通過與流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性點的保守殘基段的不同部位特異性結(jié)合，從而造成酶活性喪失，使依附在糖蛋白和糖脂上的末端唾液酸不能裂解，從而導(dǎo)致流感病毒子代毒粒不能從感染細胞表面釋放和阻斷病毒的播散［20-21］。納米銀顆粒具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等，可以輕易地進入病原體［22］。納米銀可以與菌體酶蛋白的巰基結(jié)合，使酶失活，從而達到殺菌的作用;納米銀可以與DNA 的堿基結(jié)合，使DNA 變性，導(dǎo)致細菌失活［23］;納米銀的抗菌效能與納米粒子的總面積有關(guān)。納米銀多靶點的非特異性抗菌和抗病毒作用，使其在應(yīng)用過程中不易產(chǎn)生耐藥性［24］。納米銀對小鼠和細胞無明顯的毒性作用［25］，其用于黏膜局部抗病毒將成為一種新的研究方向。本研究通過鼻腔給藥的治療方法，證實納米銀對小鼠流感有很好的治療效果，為納米銀臨床黏膜局部抗流感病毒提供了實驗數(shù)據(jù)。

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