程學(xué)英，劉 奔，鐘麗珍，趙 華，劉艷麗，張大偉，王劍鋒

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬大連中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，遼寧大連116033;2.大連醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧大連116044)

慢性酒精中毒在國(guó)內(nèi)外均是一個(gè)社會(huì)性健康問(wèn)題，可引起機(jī)體多系統(tǒng)發(fā)生病變［1］。目前對(duì)酒精中毒性肝病、腦病及周圍神經(jīng)病已有較多研究，但對(duì)酒精中毒性肌病報(bào)道較少。慢性酒精中毒性肌病是由于長(zhǎng)期酗酒引起的一種肌肉病變，隨著社會(huì)的進(jìn)步和發(fā)展，中國(guó)的慢性酒精中毒性肌病發(fā)病率也呈現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但是目前國(guó)內(nèi)對(duì)于其發(fā)病機(jī)制等相關(guān)學(xué)科的研究尚處于起步階段［2］。與此同時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)的狀態(tài)能反應(yīng)機(jī)體整體的健康水平，研究慢性酒精中毒性肌病發(fā)生時(shí)體內(nèi)免疫狀態(tài)的變化對(duì)此病的發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療具有雙重意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠50 只，體重(200 ±20)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由食水，置于溫度:20 ～25 ℃，濕度:50% ～60%，12 h 光照、12 h 黑暗條件下飼養(yǎng)，每5 ～6 只為一小組分養(yǎng)在籠中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2008—0002。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

飼料:在標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)飼料的配方基礎(chǔ)上，每公斤再加入雞蛋2 個(gè)，玉米油170 mL，蒸熟后外加一定量魚(yú)肝油、多維素，混合制成改良的全營(yíng)養(yǎng)高脂飼料，每天現(xiàn)做。該飼料中蛋白∶脂肪∶碳水化合物(能量比)=17%∶31%∶52%，與國(guó)外Lieber -Decarli 液體飼料中各成分能量比相同［2］。

灌胃液:56°紅星牌二鍋頭(北京釀酒總廠)，蔗糖水溶液。

實(shí)驗(yàn)儀器:721 分光光度計(jì)(精科，中國(guó))，MK3型酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))，流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))，RM2255 型切片機(jī)(Leica，瑞士)，120 kV 透射電子顯微鏡(中國(guó)香港)。

1.2 方法

1.2.1 慢性酒精中毒性肌病(chronic alcoholic myopathy，CAM)模型的建立:按照國(guó)內(nèi)改良的慢性酒精中毒性肌病模型建立方法［2］建立模型:實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前每只大鼠進(jìn)行稱重，按隨機(jī)表法編號(hào)分組，分為實(shí)驗(yàn)組30 只，對(duì)照組20 只。前1 個(gè)月每10 天稱重1次，以后每5 天稱重1 次。每天清晨定時(shí)(9 點(diǎn))給大鼠用56°紅星牌二鍋頭灌胃，對(duì)照組給予含與酒精熱量相等的蔗糖灌胃，同時(shí)喂飼相同的全營(yíng)養(yǎng)高脂飼料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意觀察大鼠的鼻尖濕潤(rùn)度、糞便成形度、皮毛光滑度等健康狀況，以及灌胃后酒醉程度。于第10 周成模后取兩組大鼠跖肌進(jìn)行蘇木素—伊紅(HE)染色與透射電鏡觀察，其余操作按照實(shí)驗(yàn)要求分別進(jìn)行處理。

1.2.2 透射電鏡觀察肌肉亞顯微結(jié)構(gòu):加入3%戊二醛固定兩組大鼠跖肌，4 ℃過(guò)夜。之后進(jìn)行如下操作:于4 ℃用1% 四氧化鋨固定1 h;漂洗后用1%鋨酸固定液固定3 h;依次進(jìn)行梯度脫水、包埋、固化及超薄切片;最后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，于透射電鏡下觀察肌肉超微結(jié)構(gòu)的特征。

1.2.3 抗原免疫與采血:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠均于第6 周灌胃前腹腔注射30% 卵清蛋白抗原，1.5 mL/只［3］，并于第7 周、8 周同樣方法加強(qiáng)免疫兩次。于第9 周開(kāi)始尾靜脈采血，20 μL/只，連續(xù)采集7 d，直至第10 周成模。

1.2.4 抗卵清抗體的檢測(cè):取卵白抗原液，用包被液20 倍稀釋，作為包被抗原。向聚苯乙烯微孔反應(yīng)板中每孔加入100 μL 包被抗原，置于4 ℃冰箱過(guò)夜后，用洗滌液洗滌3 次，5 min/次，最后在濾紙上拍干，待用。20 μL 全血加于180 μL 標(biāo)本稀釋液中，每個(gè)標(biāo)本用三復(fù)孔法加于ELISA 檢測(cè)板。每個(gè)反應(yīng)板預(yù)留30 孔，加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清，置于37 ℃孵育箱30 min，棄去拍干，洗滌液洗滌3 次，3 min/次，棄去拍干。取1 mL 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A 蛋白(SPA-HRP)溶液，用標(biāo)本稀釋液40 倍稀釋后，每孔加入100 μL，37 ℃孵育30 min 后取出，用洗滌液洗滌3 次，3 min/次。在濾紙上拍干后，每孔依次滴加底物液A 和B 各1 滴，于避光處反應(yīng)15 min 后，每孔加入終止液1 滴，于450 nm 處比色，測(cè)定OD 值。取3 個(gè)平行孔結(jié)果的中位值為最終結(jié)果。其中，以標(biāo)本稀釋液代替待檢血清，設(shè)為空白對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清的效價(jià)及所測(cè)OD 值，用SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程，將所測(cè)OD 值通過(guò)線性方程換算成標(biāo)準(zhǔn)單位。標(biāo)準(zhǔn)血清及待檢血清OD 值在計(jì)算時(shí)均先減去空白對(duì)照OD 值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀CD19 陽(yáng)性B 細(xì)胞檢測(cè):取大鼠新鮮全血200 μL 加于EDTA 抗凝管，輕搖混合。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。主要操作如下:將混合均勻的抗凝全血100 μL 加于裝有4 μL 鼠抗鼠CD19/CD3 熒光抗體的試管，漩渦振蕩5 s，混合均勻，室溫避光孵育30 min。另取100 μL 抗凝血加于裝有同型對(duì)照抗體的試管，同樣方法標(biāo)記30 min。30 min 后，加入紅細(xì)胞溶血素室溫避光孵育完全破壞紅細(xì)胞，將兩組試管2 000 r/min 離心5min，小心棄去上清，生理鹽水洗滌2 次后，加0.5 mL 生理鹽水稀釋細(xì)胞，輕搖混合均勻，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)。以陽(yáng)性百分率為測(cè)量指標(biāo)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件(10.0 版)完成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)均采用組間t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢性酒精中毒性肌病模型大鼠與對(duì)照組大鼠體重的比較

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠初始體重(g)無(wú)明顯差異(198.36±2.38 與200.32 ±3.01，P=0.561)，而在造模進(jìn)行至第7 周時(shí)(第8 次稱重)，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重與對(duì)照組比較差異開(kāi)始出現(xiàn)顯著性意義(326.03 ±6.63與360.88±8.28，P=0.006)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重已明顯低于對(duì)照組，差異有顯著性意義(343.26 ±7.56 與411.23 ±9.00，P =0.000)。兩組大鼠各測(cè)量點(diǎn)的體重變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

2.2 大鼠肌肉組織形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組大鼠肌纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)正常;實(shí)驗(yàn)組大鼠II 型肌纖維明顯萎縮，呈多邊形、三角形等不規(guī)則形狀;細(xì)胞核與胞漿也出現(xiàn)相應(yīng)病理改變，如空泡樣變性等，這些變化與文獻(xiàn)［2，4-5］報(bào)道相一致，證明慢性酒精中毒性肌病模型大鼠造模成功。兩組大鼠肌肉組織形態(tài)學(xué)觀察見(jiàn)圖2。

圖1 慢性酒精中毒性肌病模型大鼠與對(duì)照組大鼠體重的變化趨勢(shì)Fig 1 The weight comparison between the chronic alcoholic myopathy model group rats and the control group rats

圖2 兩組大鼠肌肉組織形態(tài)學(xué)觀察(HE ×1 600)Fig 2 Two muscle tissue morphology observation of the two group rats (HE ×1 600)

2.3 大鼠肌肉組織電鏡觀察

對(duì)照組大鼠肌原纖維中每?jī)蓷lZ 線間距離相等，Z 線規(guī)整、連續(xù);實(shí)驗(yàn)組大鼠肌原纖維中Z 線不規(guī)則，呈現(xiàn)斷裂或不連續(xù)狀態(tài)，肌原纖維呈現(xiàn)明顯萎縮，細(xì)胞核和線粒體也出現(xiàn)相應(yīng)病理變化，見(jiàn)圖3。

2.4 大鼠體內(nèi)抗卵清抗體的檢測(cè)

不同采血天數(shù)時(shí)兩組大鼠抗卵清蛋白抗體的組間檢驗(yàn)結(jié)果(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的抗體單位平均值)見(jiàn)圖4，在不同采血時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組大鼠抗卵清蛋白抗體單位與對(duì)照組大鼠比較差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。

2.5 兩組大鼠CD19 陽(yáng)性B 細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠CD19陽(yáng)性B 細(xì)胞低于對(duì)照組，差異有顯著性意義(23.68 ±2.63 與14.23 ±0.40，P=0.000)，見(jiàn)圖5。

3 討 論

圖3 兩組大鼠肌肉組織電鏡觀察(×15 000)Fig 3 The muscle tissue electron microscopy observation of the two group rats (×15 000)

國(guó)外有資料顯示約1/3 ～2/3 的慢性嗜酒者出現(xiàn)肌肉病變，慢性酒精中毒性肌病要比酒精性肝硬化、酒精性腦病、酒精性周圍神經(jīng)病以及酒精性胃腸病變更多見(jiàn)［6］。一項(xiàng)研究顯示在250 個(gè)慢性嗜酒者中，只有20 人診斷為酒精性肝硬化，與之相比，有117 人診斷為酒精中毒性肌?。?］。這種病變已成為北美、歐洲等地區(qū)嗜酒者中最常見(jiàn)的肌肉病變［8］。與此同時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)的狀態(tài)能反應(yīng)機(jī)體整體的健康水平，研究慢性酒精中毒性肌病發(fā)生時(shí)體內(nèi)免疫功能的狀態(tài)對(duì)此病的發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療具有雙重意義。

本研究采用酒精灌胃方法造模，為接近臨床實(shí)際病例，采用成品市售二鍋頭酒為灌胃液。為保證其純度，購(gòu)買后，雙倍稀釋，用分光光度法［11］驗(yàn)證其酒精含量。實(shí)驗(yàn)中去除了酒精性肝病造模飼料中促進(jìn)肝損傷的吡唑，保留了可延緩酒精代謝、維持血液中酒精濃度的玉米油，并調(diào)整了灌胃液中的酒精濃度，以減輕酒精對(duì)肝臟的損害。本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建大鼠慢性酒精中毒性肌病模型的同時(shí)，對(duì)其體液免疫功能的變化進(jìn)行了探索性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)慢性酒精中毒性肌病發(fā)生的時(shí)候，大鼠機(jī)體的直觀健康狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，如實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)食量明顯減少，體重不增，甚至下降，精神狀態(tài)差，皮毛無(wú)光澤，與文獻(xiàn)［2］報(bào)道相一致。與此同時(shí)，大鼠機(jī)體的免疫功能也發(fā)生變化?，F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為，高等動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答是由多細(xì)胞系完成的，其中B 細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫。當(dāng)發(fā)生初次免疫應(yīng)答的時(shí)候，機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是IgM 分子，對(duì)抗原結(jié)合力低;而再次應(yīng)答的時(shí)候則主要為IgG 分子，為高親和性抗體［9］。ELISA 法可以用來(lái)測(cè)定動(dòng)物血清中待測(cè)分子的表達(dá)水平［10］，本研究在實(shí)驗(yàn)組大鼠第6 周時(shí)給予初次免疫，并于第7、8 周時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，當(dāng)造模成功時(shí)，ELISA 法檢測(cè)的大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體主要為IgG 分子，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，可以反映出機(jī)體的體液免疫功能。同時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示作為B 細(xì)胞主要的表面標(biāo)志之一，CD19 陽(yáng)性的B細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組中也呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，說(shuō)明介導(dǎo)抗體產(chǎn)生的主要細(xì)胞群——B 細(xì)胞的功能在慢性酒精中毒性肌病發(fā)生的時(shí)候同時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

長(zhǎng)期過(guò)量飲酒可致機(jī)體多個(gè)器官、系統(tǒng)同時(shí)出現(xiàn)損害，本研究對(duì)慢性酒精中毒性肌病發(fā)生時(shí)伴隨的體液免疫功能變化所進(jìn)行的初步探索，為慢性酒精中毒性肌病的發(fā)病機(jī)制研究及治療、預(yù)后提供了一定的參考。與遺傳性肌病相比，慢性酒精中毒性肌病是一種經(jīng)治療病情可有不同程度緩解，甚至治愈的疾病，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注其分子水平的作用機(jī)制［12］，對(duì)慢性酒精中毒性肌病細(xì)胞分子水平的免疫學(xué)研究可以為其他代謝性肌病的研究奠定基礎(chǔ)。

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