劉 冰，陽 潔 (.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院藥理系，廣東 廣州 50006;.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西 南寧5300)

肺癌中80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinomas，NSCLCs)，早期診斷率極低，大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，需要化學(xué)藥物治療［1］。近年的研究表明，他汀類還能顯著抑制前列腺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［2-3］。但阿托伐他汀(ATV)能否影響NSCLCs的增殖仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究阿托伐他汀對(duì)三株NSCLCs細(xì)胞(A549細(xì)胞、H358細(xì)胞、Calu3細(xì)胞)增殖的影響及其可能的作用機(jī)制，為NSCLCs的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 阿托伐他汀，DMEM、胎牛血清，青霉素、鏈霉素、噻唑藍(lán)、二甲基亞砜，RhoA siRNA、control siRNA、單克隆抗RhoA抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔抗體、β-actin抗體，Lipofectamine 2000，RhoA特異性抑制劑 C3 transferase，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，Rho-GTP親和力測(cè)試板。

1.1.2 NSCLCs細(xì)胞株 A549 細(xì)胞、H358 細(xì)胞、Calu3 細(xì)胞用含10%胎牛血清及0.1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用改進(jìn)的MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況［4］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A549細(xì)胞、H358細(xì)胞、Calu3細(xì)胞，用無血清DMEM重懸后，以5×105/mL接種于96孔板，每孔100 μl，細(xì)胞培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的阿托伐他汀和RhoA siRNA、control siRNA、RhoA特異性抑制劑(RhoA inhibitor)C3 transferase處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(細(xì)胞不加藥物處理)、空白對(duì)照組(無細(xì)胞、僅加無血清DMEM)，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，72 h后，每孔加入5 mg/mL的噻唑藍(lán)20 μl，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)量各孔的吸光值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞的相對(duì)增殖率(%)=(OD處理組-空白對(duì)照組)/(OD陰性對(duì)照組-空白對(duì)照組)×100%。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 三株細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至50% ～70%以上融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。RhoA siRNA、control siRNA轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行［5］，細(xì)胞孵育過夜后，再培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)置空脂質(zhì)體組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Western blotting檢測(cè)RhoA的蛋白表達(dá)，觀察 siRNA的干擾效果。

1.2.3 Western blotting 根據(jù)文獻(xiàn)［6］的方法，裂解細(xì)胞、提取總蛋白并測(cè)定濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉30 min，單克隆抗RhoA抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯色，凝膠成像儀掃描并分析圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 RhoA 活性測(cè)定 采用 Sterpetti的方法［7］，收集細(xì)胞膜提取物25 μg，在Rho-GTP親和力測(cè)試板上孵育45 min，再與抗體檢測(cè)試劑孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光信號(hào)，觀察RhoA活性的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATV對(duì)NSCLCs細(xì)胞增殖的影響

與未處理組(control)相比，0.1%DMSO溶劑對(duì)照組對(duì)三株NSCLCs細(xì)胞的增殖無明顯影響(P＞0.05);與DMSO溶劑對(duì)照組比較，0.1～25.0 μmol/L 的 ATV 能明顯抑制三株 NSCLCs細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1。

2.2 ATV對(duì)NSCLCs細(xì)胞RhoA活性的影響

與未處理組(control)相比，0.1%DMSO溶劑對(duì)照組對(duì)三株NSCLCs細(xì)胞的 RhoA 活性無明顯影響(P ＞0.05);0.1～25.0 μmol/L的ATV處理細(xì)胞48 h后，能明顯抑制A549細(xì)胞、H358細(xì)胞的 RhoA 活性，0.5～25.0 μmol/L的 ATV 能明顯抑制Calu3細(xì)胞的 RhoA活性，均呈濃度依賴性(P＜0.05或P ＜0.01)，見圖2A。此外，2.5 μmol/L ATV 能持續(xù)地抑制三株細(xì)胞的 RhoA活性至96 h，且均呈時(shí)間依賴性(P＜0.05或P ＜0.01)，但2.5 μmol/L ATV 在處理 Calu3 細(xì)胞細(xì)胞 48 h后才明顯抑制細(xì)胞的RhoA活性，并持續(xù)抑制到96 h(P＜0.05或P ＜0.01)，見圖2B。

2.3 RhoA特異性抑制劑對(duì)NSCLCs細(xì)胞增殖的影響

與未處理組(control)比較，用1 g/mL的RhoA特異性抑制劑C3 transferase預(yù)處理細(xì)胞1 h后，能使A549細(xì)胞、H358細(xì)胞、Calu3細(xì)胞的RhoA活性分別顯著下降70.79%(P＜0.01)、79.60%(P ＜0.01)、77.75%(P ＜0.01)，見圖3A。與未處理組(control)比較，單用 2.5 μmol/L ATV、單用 10.0 μmol/L ATV、單用1 g/mL的RhoA特異性抑制劑C3 transferase、合用1 g/mL C3 transferase+2.5 μmol/L ATV、合用 1 g/mL C3 transferase+10.0 μmol/L ATV等5個(gè)組均能明顯抑制A549細(xì)胞、H358細(xì)胞、Calu3細(xì)胞增殖(P＜0.01)。但是，與單用1 g/mL的RhoA特異性抑制劑C3 transferase組比較，合用1 g/mL C3 transferase+2.5 μmol/L ATV、合用 1 g/ml C3 transferase+10.0 μmol/L ATV兩個(gè)組均無顯著差異(P＞0.05)，見圖3B。

圖1 ATV對(duì)NSCLCs細(xì)胞增殖的影響

圖2 ATV對(duì)NSCLCs細(xì)胞RhoA活性的影響

2.4 RhoA siRNA對(duì)NSCLCs細(xì)胞增殖的影響

各組間β-actin表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，表明各組間蛋白的上樣量基本一致。與未轉(zhuǎn)染組比較，A549細(xì)胞、H358細(xì)胞、Calu3細(xì)胞被轉(zhuǎn)染control siRNA后，三株細(xì)胞內(nèi)RhoA表達(dá)無顯著變化(P＞0.05);但細(xì)胞被轉(zhuǎn)染RhoA siRNA后，RhoA蛋白的表達(dá)明顯下降，其抑制率分別為(76.23±8.05)%、(73.83±6.04)%、(77.97 ±10.98)%，表明轉(zhuǎn)染 RhoA siRNA 能有效沉默三株NSCLCc細(xì)胞的RhoA蛋白表達(dá)，見圖4A。與未轉(zhuǎn)染組(control)比較，轉(zhuǎn)染control siRNA組的細(xì)胞增殖無顯著變化(P ＞0.05);轉(zhuǎn)染 control siRNA 并合用 2.5 μmol/L ATV 組、轉(zhuǎn)染 control siRNA 并合用10.0 μmol/L ATV 組、轉(zhuǎn)染RhoA siRNA組、轉(zhuǎn)染 RhoA siRNA 并合用2.5 μmol/L ATV 組、轉(zhuǎn)染 RhoA siRNA并合用10.0 μmol/L ATV組均能顯著抑制三株細(xì)胞增殖(P ＜0.01)。但是，與僅轉(zhuǎn)染RhoAsiRNA組比較，轉(zhuǎn)染RhoA siRNA并合用2.5 μmol/L ATV組、轉(zhuǎn)染 RhoA siRNA并合用10.0 μmol/L ATV 組均無顯著差異(P ＞0.05)，見圖 4B。

圖3 RhoA特異性抑制劑對(duì)NSCLCs細(xì)胞增殖的影響

圖4 RhoA siRNA對(duì)NSCLCs細(xì)胞增殖的影響

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物還對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)分化或凋亡、抑制血管生成及降低侵襲轉(zhuǎn)移能力等作用［8］。ATV對(duì)乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖均有顯著抑制作用［9］，是一種很有潛力的抗腫瘤藥物。

RhoA屬于GTP/GDP結(jié)合GTP酶的Ras超家族，已被證明在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用［10］。RhoA在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)和過度激活［11］。過度活化的RhoA能觸發(fā)后續(xù)的PI3K-Akt通路的激活，而該通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞生成及細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路［12］。Fromigue 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的ATV(10 μmol/L)可有效抑制RhoA介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的激活，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。然而，ATV能否影響 NSCLCs細(xì)胞的 RhoA活性以及RhoA激活是否與NSCLCs細(xì)胞增殖有關(guān)仍不清楚。本研究中，ATV呈濃度依賴性地顯著抑制NSCLCs細(xì)胞增殖，并且呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性地顯著抑制NSCLCs細(xì)胞的RhoA活性。用RhoA特異性抑制劑C3 transferase降低RhoA活性會(huì)明顯抑制NSCLCs細(xì)胞增殖。我們進(jìn)一步用RhoA siRNA轉(zhuǎn)染NSCLCs細(xì)胞，證實(shí)在有效沉默RhoA蛋白表達(dá)后，也會(huì)明顯抑制NSCLCs細(xì)胞增殖。該結(jié)果提示，ATV能有效地抑制NSCLCs細(xì)胞增殖，其機(jī)制與其降低 NSCLCs細(xì)胞的RhoA活性密切相關(guān)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，用 RhoA特異性抑制劑C3 transferase或RhoA siRNA抑制RhoA活性時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用ATV不能產(chǎn)生抑制NSCLCs細(xì)胞增殖的協(xié)同效應(yīng)，而是與單用RhoA特異性抑制劑C3 transferase或RhoA siRNA的作用相似。這提示，在RhoA活性被抑制后，ATV不能抑制NSCLCs細(xì)胞增殖。如果ATV抑制NSCLCs細(xì)胞增殖不是通過抑制RhoA活性而產(chǎn)生，那么在RhoA活性被抑制后，ATV還應(yīng)發(fā)揮本身對(duì)NSCLCs細(xì)胞增殖的抑制作用。相似結(jié)果在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道，如Wang等研究發(fā)現(xiàn)［14］，重組的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rh-HGF)能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞生存從而抵消順鉑的治療作用，用抗HGF中和抗體治療能明顯增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，但用Akt siRNA阻斷Akt表達(dá)時(shí)，rh-HGF和抗HGF的中和抗體對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性僅為微弱作用或無作用。因此Wang等認(rèn)為rh-HGF和抗HGF中和抗體對(duì)順鉑療效的影響主要是依賴于對(duì)PI3K-Akt通路的抑制。本研究的上述結(jié)果也證實(shí)了此觀點(diǎn)。因此，本文認(rèn)為，RhoA激活與NSCLCs細(xì)胞增殖密切相關(guān)，ATV主要依賴于抑制RhoA活性從而減少NSCLCs細(xì)胞增殖。這提示，ATV可能作為一種有潛力的抗腫瘤藥物用于NSCLCs的治療，但其具體的作用機(jī)制和信號(hào)途徑仍需進(jìn)一步闡明。

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