孟彥麗，王 切，王素玲，蘇玉紅*，王 真，董 輝

（1.華北石油管理局總醫(yī)院急診科，河北任丘062552；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，河北石家莊050017；

3.河北省血液中心檢驗科，河北石家莊050071；4.華北石油管理局總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北任丘062552）

·論 著·

PrxⅤ和CAT在大鼠腎缺血再灌注損傷模型的表達(dá)變化

孟彥麗1，王 切2，王素玲3，蘇玉紅2*，王 真4，董 輝1

（1.華北石油管理局總醫(yī)院急診科，河北任丘062552；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，河北石家莊050017；

3.河北省血液中心檢驗科，河北石家莊050071；4.華北石油管理局總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北任丘062552）

目的觀察過氧化物氧化還原酶（peroxiredoxinⅤ，PrxⅤ）和過氧化氫酶（catalases，CAT）在大鼠腎缺血再灌注損傷模型的表達(dá)變化，探討其在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。方法通過無損傷動脈夾鉗夾腎動脈法建立腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24h后取血和腎臟。苦味酸法和酶偶聯(lián)速率法分別檢測血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度；HE法觀察大鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法觀察PrxⅤ和CAT在腎臟缺血再灌注損傷中mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果與對照組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠血清中SCr和BUN的含量明顯升高。HE結(jié)果提示腎臟缺血再灌注損傷組大鼠的腎組織明顯受損。PrxⅤ和CATmRNA水平也明顯升高。結(jié)論P(yáng)rxⅤ和CAT在腎臟缺血再灌注損傷中均發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激作用。

再灌注損傷；過氧化氫酶；氧化性應(yīng)激

腎缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是急性腎動脈阻斷或腎臟移植等臨床治療過程中常見的病理生理過程［1－4］。當(dāng)腎臟發(fā)生缺血再灌注時會產(chǎn)生大量的活性氧族（reactive oxygen species，ROS），這是其損傷的重要機(jī)制之一［5－7］。ROS的重要成員之一為H2O2，它可以通過破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子來影響細(xì)胞功能，進(jìn)而引起細(xì)胞和組織死亡［8－9］。過氧化物氧化還原酶（peroxiredoxin，Prx）蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶系，它們具有清除ROS的作用［10］。PrxⅤ是其成員之一，它在腎臟表達(dá)最高［11－12］。過氧化氫酶（catalases，CAT）主要存在于過氧化物酶體內(nèi)，負(fù)責(zé)清除脂類代謝過程中產(chǎn)生的H2O2［13］。當(dāng)腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷，PrxⅤ和CAT的mRNA水平如何改變，尚未見報道。

1 材料與方法

1．1 主要試劑：瓊脂糖、溴化乙啶、RT試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品；Trizol、Taq DNA聚合酶均為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1．2 模型的建立和樣品處理：雄性Wister大鼠12只，體質(zhì)量（200±10）g，購于河北省實驗動物中心，隨機(jī)分為對照組（control）和RZRI組，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（5mL/kg），參照余曉東等［14］的方法，RIRI組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟，先切除右腎，然后鈍性分離左腎動脈，在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開動脈夾，恢復(fù)血液供應(yīng)，肉眼可見腎動脈充盈，腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功。對照組大鼠開腹后只切除右腎，分離左腎動脈，但不夾閉左腎動脈。24h后收集血液，3 000r/min離心10min，分離血清用于血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度測定；處死大鼠取腎，一部分置于液氮中用于CAT和PrxⅤmRNA水平測定，一部分4％多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色，觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

1．3 血清SCr和BUN濃度測定：血清中SCr和BUN濃度均采用中生北控測定試劑盒測定。

1．4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察：腎組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)變化并進(jìn)行圖像分析。

1．5 腎組織PrxⅤ和CAT mRNA水平測定：Trizol法提取腎組織總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）。分別以PrxⅤ、CAT的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的mRNA相對表達(dá)量。PrxⅤ和CAT的引物序列見表1。

表1 PrxⅤ和CAT引物序列Table 1 Primers of PrxⅤand CAT

1．6 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料以±s表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)改變：光學(xué)顯微鏡下可見對照組大鼠的腎小球、近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠的腎小球萎縮，體積變??；腎小囊擴(kuò)張；腎小管管腔明顯擴(kuò)張，個別近曲小管上皮細(xì)胞水腫，胞漿疏松化；腎間質(zhì)水腫，腎小管間隙擴(kuò)大；集合管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、上皮水腫等改變（圖1，2）。

2．2 血清SCr和BUN的濃度：與對照組相比，RIRI組血清中SCr和BUN的濃度均明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 2組血清SCr和BUN的濃度Table 2 SCr and serum BUN level in two groups（n＝6，±s）

表2 2組血清SCr和BUN的濃度Table 2 SCr and serum BUN level in two groups（n＝6，±s）

*P＜0.05 vs control group by t testSCr：serum creatinine；BUN：blood urea nitrogen；RIRI：renal ischemia reperfusion injury

Groups SCr（μmol/L）BUN（mmol/L）Control 103.444±8.465 4.462±0.541 RIRI 131.153±17.814*13.685±4.397*

2．3 腎組織PrxⅤ、CAT mRNA水平：與對照組相比，RIRI組大鼠腎組織內(nèi)的PrxⅤ和CAT的mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。見表3，圖3。

表3 PrxⅤ和CAT的m RNA表達(dá)Table 3 Expression change of PrxⅤand CAT（n＝6，±s）

表3 PrxⅤ和CAT的m RNA表達(dá)Table 3 Expression change of PrxⅤand CAT（n＝6，±s）

*P＜0.05 vs control group by t testPrxⅤ：peroxiredoxinⅤ；CAT：catalases；RIRI：renal ischemia reperfusion injury

Groups PrxⅤCAT Control 1.192±0.121 0.841±0.034 RIRI 1.606±0.065*1.106±0.018*

圖1 RIRI組腎小球、腎小管形態(tài)改變（HE×400）Figure 1 Morphological changes of glomeruli and tubules in RIRIgroup（HE×400）

圖2 正常組腎小球、腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE×400）Figure 2 Morphological ofglomeruliand tubules in control group（HE× 400）

圖3 PrxⅤ和CAT的mRNA表達(dá)Figure 3 Expression of PrxⅤand CAT

3 討 論

RIRI常發(fā)生在腎擠壓傷、腎移植、失血性休克以及部分腎切除等臨床治療過程中，也是導(dǎo)致患者出現(xiàn)急性腎損傷、腎移植失敗的重要原因［1－4］。因此，尋找一條能夠有效避免或減輕RIRI的途徑對提高患者的治療效果、改善愈后將具有重要意義。

研究證實氧化應(yīng)激是導(dǎo)致RIRI的重要機(jī)制之一［5－7］。PrxⅤ幾乎在所有組織中均具有清除H2O2的作用［11－12］。由于其在腎臟表達(dá)最高，因此推測它可能在腎臟發(fā)揮了比其他器官更重要的抗氧化應(yīng)激損傷作用。CAT主要負(fù)責(zé)清除脂類代謝過程中產(chǎn)生的H2O2［13］，以往對于CAT在RIRI中的作用研究只局限于活性和蛋白水平，并未對其基因水平的表達(dá)變化進(jìn)行探討。因此，本研究的目的是觀察PrxⅤ和CAT在腎臟缺血再灌注損傷中基因水平的改變，進(jìn)一步證實它們在清除H2O2中的作用。

首先，我們通過無損傷血管夾夾閉大鼠左腎動脈，45min后去掉血管夾恢復(fù)腎臟血液供應(yīng)，制造RIRI模型。再灌注24h后的光學(xué)顯微鏡顯示，RIRI組大鼠的腎小球和腎小管均出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)改變。SCr和BUN是臨床上常用的2個腎功能檢查指標(biāo)。當(dāng)腎臟受損、腎小球濾過率降低時，血清內(nèi)SCr和BUN的濃度會隨之升高。在本研究中，RIRI組大鼠血清內(nèi)SCr和BUN的濃度與對照組相比均明顯升高。進(jìn)一步說明此時的腎功能已明顯受損。以上這些結(jié)果表明，我們的RIRI模型是成立的。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，RIRI組大鼠PrxⅤ和CATmRNA水平均明顯升高。當(dāng)腎臟內(nèi)有大量的ROS產(chǎn)生并處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)時，清除H2O2的關(guān)鍵酶PrxⅤ和CAT的表達(dá)也隨之明顯增強(qiáng)，這就進(jìn)一步證明，PrxⅤ和CAT在清除缺血再灌注損傷所誘發(fā)的ROS中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，PrxⅤ和CAT在抵抗RIRI所誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷中具有重要作用。通過上調(diào)PrxⅤ和CAT的活性以及表達(dá)水平來加速清除過多的ROS，可能成為一條減輕RIRI程度、改善患者愈后的新途徑。

［1］RAMíREZ V，TRUJILLO J，VALDES R，et al.Adrenalectomy prevents renal ischemia-reperfusion injury［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297（4）：F932－942.

［2］BAGHERIF，GOL A，DABIRIS，et al.Preventive effect of garlic juice on renal reperfusion injury［J］.Iran JKidney Dis，2011，5（3）：194－200.

［3］ALAN C，KOCOGLU H，ALTINTASR，et al.Protective effect of decorin on acute ischaemia-reperfusion injury in the rat kidney［J］.Arch Med Sci，2011，7（2）：211－216.

［4］SIEDLECKIAM，JIN X，THOMASW，et al.RGS4，a GTPase activator，improves renal function in ischemia-reperfusion injury［J］.Kidney Int，2011，80（3）：263－271.

［5］ATILGAN D，PARLAKTAS BS，ULUOCAK N，et al.Effects of melatonin on partial unilateral ureteral obstruction induced oxidative injury in rat kidney［J］.Urol Ann，2012，4（2）：89－93.

［7］KIM J，JANG HS，PARK KM.Reactive oxygen species generated by renal ischemia and reperfusion trigger protection against subsequent renal ischemia and reperfusion injury inmice［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2010，298（1）：F158－166.

［8］MANSANO AM，VIANNA PT，F(xiàn)ABRIS VE，et al.Prevention of renal ischemia/reperfusion injury in ratsusing acetylcysteine after anesthesia with isoflurane［J］.Acta Cir Bras，2012，27（4）：340－345.

［9］RABILLOUD T，HELLER M，GASNIER F，et al.Proteomics analysis of cellular response to oxidative stress［J］.JBiol Chem，2002，277（22）：19396－19401.

［10］PARK KJ，KIM YJ，KIM J，et al.Protective effects of peroxiredoxin on hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis in cardiomyocytes［J］.Korean Circ J，2012，42（1）：23－32.

［11］SEOMS，KANG SW，KIMIK，etal.Identification ofa new type of mammalian peroxiredoxin that forms an intramolecular disulfide as a reaction intermediate［J］.J Biol Chem，2000，275（27）：20346－20354.

［12］CHANG TS，JEONG W，CHOI SY，et al.Regulation of peroxiredoxinⅠactivity by Cdc2-mediated phosphorylation［J］.J Biol Chem，2002，277（28）：25370－25376.

［13］KLINGELHOEFFER C，K?MMERER U，KOOSPAL M，et al. Natural resistance to ascorbic acid induced oxidative stress is mainlymediated by catalase activity in human cancer cells and catalase-silencing sensitizes to oxidative stress［J］.BMC Complement Altern Med，2012，12（1）：61－83.

［14］余曉東，廖波，鄧顯忠，等.一種新型實用的大鼠腎缺血再灌注損傷模型的建立［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（13）：1283－1284.

（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION OF PrxⅤ，CAT mRNA IN RENAL ISCHEM IA-REPERFUSION INJURY OF RATS

MENG Yanli1，WANG Qie2，WANG Suling3，SU Yuhong2*，WANG Zhen4，DONG Hui1
（1．Department of Emergency，General Hospital of Northern China Oil Field，Hebei Province，Renqiu 062552，China；
2．Department of Anatomy，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，
China；3．Department of Laboratory，Hebei Blood Center，Shijiazhuang 050071，China；4．Department of
Neurology，General Hospital of Northern China Oil Field，Hebei Province，Renqiu 062552，China）

Objective To observe the expression of peroxiredoxinⅤ（PrxⅤ），catalases（CAT）in renal ischemia-reperfusion injury of rats and study their role in oxidative-stress response.MethodsThe renal artery of rats was clipped with non-damage vascular clamp to creat renal ischemia-reperfusion injurymodel.After 24 hours of reperfusion，the blood and kidney were taken.The serum creatinine（SCr）and blood urea nitrogen（BUN）were detected with picric acidmethod and enzyme coupling ratemethod，the morphology change was observed by HE staining.The PrxⅤand CAT mRNA expression were evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsCompared with the control group，SCr and BUN of renal ischemia-reperfusion injury group were significantly increased.The HE staining Results of renal ischemia-reperfusion injury group showed that kidney was impaired.The PrxⅤand CATmRNA expression were also enhanced.ConclusionPrxⅤand CATmay play an important role in inhibiting the oxidative-stress response in the process of renal ischemia-reperfusion injury.

reperfusion injury；catalase；oxidative stress

2012－09－03；

2012－12－08

孟彥麗（1978－），女，河北阜平人，華北石油總醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事急診科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：suyuhong1227＠yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.005

R364.1

A

1007-3205（2013）05-0508-04