周學(xué)亮，萬 力，劉季春

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科，江西南昌330006）

Notch信號(hào)通路于90年前經(jīng)摩根首次發(fā)現(xiàn)，其特點(diǎn)為該通路的受體Notch活性受糖基化、胞內(nèi)運(yùn)輸差異和泛素化降解調(diào)控，而不依賴于第二信使的放大［1］。在多種生物的心臟發(fā)育期，Notch信號(hào)參與了心肌細(xì)胞分化、房室溝分界、瓣膜發(fā)育、流出道重塑、心室小梁形成等諸多過程［2-4］；心臟發(fā)育成熟后，Notch的作用可控制心血管系統(tǒng)對(duì)缺血缺氧損傷的反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞纖維化，增強(qiáng)受損后心肌細(xì)胞活力［5-7］。本研究擬采用微小干擾核糖核酸（miRNA）技術(shù)，通過設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠Notch1基因干擾序列，構(gòu)建能在真核細(xì)胞中表達(dá)miRNA序列的載體，并轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，篩選干擾大鼠Notch1基因最佳的miRNA，為進(jìn)一步觀察Notch信號(hào)通路在心肌細(xì)胞的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及菌株 H9c2心肌樣細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自Invitrogen公司。

1.1.2 干擾質(zhì)粒 BLOCK-iTTMPolⅡ miR RNAi Expres-sion Vector Kits購自Invitrogen公司。

1.1.3 主要試劑 T4DNA Ligase購自TaKaRa公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，兔Cleaved Notch1單克隆抗體購自abcam公司，小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋公司，化學(xué)發(fā)光試劑盒（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 干擾片段設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)GeneBank中的大鼠Notchl基因編碼序列（NCBI Reference Sequence：NM＿001105721.1），在Invitrogen網(wǎng)站分別在線設(shè)計(jì)3對(duì)pre-miRNA序列（表1），交Invitrogen公司合成，規(guī)格為2OD。

1.2.2 靶向Notch1miRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 將3對(duì)Oligonucleotide各自用TE Buffer溶解成200μmol／L，互補(bǔ)單鏈經(jīng)退火形成雙鏈，反應(yīng)體系：200μmol／L Top Strand Oligonucle-otide 5μL，200μmol／L Bottom Strand Oligonucleotide 5μL，10×Oligo Annialing Buffer 2μL，dddH2O 8μL；退火條件：95℃，1min→85 ℃，1min→75 ℃，1min→65 ℃，1min→55℃，1min→45℃，1min→35℃，1min→25℃，1min→25℃，10min；形成的double strand Oligonucleotide分別用dddH2O稀釋到100μmol／L。然后用載體構(gòu)建試劑盒BLOCK-iTTMPolⅡmiR RNAi Expression Vector Kits進(jìn)行重組克隆，將雙鏈的miRNA Oligo利用T4DNA Ligase各自連接到miRNA表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW／EmGFP-miR Vector中，以構(gòu)建Notch1miRNA質(zhì)粒。

表1 Notch1- 寡核苷酸序列

1.2.3 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與測序分析 將3組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，接種于Spe＋（大觀霉素）的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基平板，次日隨機(jī)挑選陽性單克隆菌落，于Spe＋LB液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基搖菌過夜，隔日小提質(zhì)粒，送北京諾賽基因組研究中心有限公司基因測序，序列無誤后分別命名為miRNA1281、miRNA4072、miRNA6637。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium（DMEM）＋10%Fetal bovine serum（FBS）培養(yǎng) H9c2心肌樣細(xì)胞，鋪12孔板，細(xì)胞生長至90%融合度時(shí)，按LipofectamineTM2000方法，分4組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：Mock組（無效對(duì)照miRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）、miRNA1281組（轉(zhuǎn)染miRNA1281）、miRNA4072組 （轉(zhuǎn) 染 miRNA4072）、miRNA6637 組 （轉(zhuǎn) 染miRNA6637）。

1.2.5 靶向Notch1miRNA干擾質(zhì)粒的篩選 4組H9c2心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，分別加90μL RIPA裂解細(xì)胞，4℃、12 000g離心提取總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）測定蛋白水平。加等量十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（2×），沸水煮10min各上樣30μg，行8%SDS-PAGE蛋白電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別用稀釋的一抗［Cleaved Notch1（1∶500）、GAPDH（1∶200）］4℃孵育過夜，次日辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶5 000）、山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）常溫孵育1h，結(jié)束后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光，檢測Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（N1ICD）的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 靶向Notch1miRNA干擾質(zhì)粒成功構(gòu)建 將雙鏈的miRNA Oligo與pcDNATM6.2-GW／EmGFP-miR Vector各自連接后，轉(zhuǎn)化Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，小提質(zhì)粒，送北京諾賽基因組研究中心有限公司基因測序，序列無誤，見圖1。

圖1 靶向Notch1miRNA干擾質(zhì)?；驕y序圖

圖2 熒光顯微鏡觀察H9c2心肌樣細(xì)胞Notch1miRNA的轉(zhuǎn)染效率

2.2 靶向Notch1miRNA干擾質(zhì)粒順利篩選 利用LipofectamineTM2000將構(gòu)建成功的miRNA1281、miRNA4072、miRNA6637干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2心肌樣細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（圖2），48h后提總蛋白，Western blot顯示N1ICD在 Mock組、miRNA1281組、miRNA4072組、miRNA6637組表達(dá)逐漸降低，以miRNA6637組表達(dá)最低，約為Mock組的90%，說明3組miRNA均可靶向干擾Notch1基因，以miRNA6637效果最佳，根據(jù)沉默效果篩選理想的Notch1miRNA：Western blot檢測H9c2心肌樣細(xì)胞miRNA轉(zhuǎn)染后N1ICD的表達(dá)（圖3）；各組N1ICD灰度值比較見圖4。

圖3 H9c2心肌樣細(xì)胞miRNA轉(zhuǎn)染后N1ICD的表達(dá)

圖4 各組N1ICD灰度值比較

3 討 論

深入研究發(fā)現(xiàn)miRNA是一類存在于生物體內(nèi)，長度約19～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過與mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，使mRNA發(fā)生降解或翻譯受抑，負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)［8-9］。在哺乳動(dòng)物中，大約50%的蛋白受miRNA調(diào)控，研究顯示miRNA幾乎參與了迄今為止所有細(xì)胞之間的調(diào)控，在細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡、增殖中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)的改變與人類多種疾病著密切相關(guān)［10］。目前研究表明miRNA對(duì)靶基因的干擾效果是小干擾RNA（siRNA）的10倍［11］。因此，采用miRNA干擾技術(shù)將會(huì)有更理想的干擾效應(yīng)。本研究通過設(shè)計(jì)合成 miRNA，成功轉(zhuǎn)入pcDNATM6.2-GW／EmGFP-miR Vector中，基因測序無誤后，脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H9c2心肌樣細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察到各組miRNA轉(zhuǎn)染效率約為80%左右，通過Western blot檢驗(yàn)3組miRNA轉(zhuǎn)染后N1ICD的表達(dá)差異，結(jié)果顯示3組N1ICD表達(dá)均降低，以miRNA6637組最為明顯，約為Mock組的90%，可見miRNA6637對(duì)Notch1的干擾效果最佳。

Notch配體在果蠅內(nèi)為Serrate家族，在哺乳動(dòng)物為Jagged／Delta家族，與配體結(jié)合后，Notch受體獲得活性發(fā)生構(gòu)象改變，經(jīng) TNF-α轉(zhuǎn)化酶（TNF-αconverting enzyme，TACE）、γsecretase的二次裂解，形成NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與重組信號(hào)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白Jκ（Recombination signal binding protein for immunoglobulin Jκ，RBP-Jκ）結(jié)合，啟動(dòng)多毛和分裂增強(qiáng)子1（Hairy and enhancer of split 1，Hes1）、多毛相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Hairy-related transcription，HRT）等靶基因的轉(zhuǎn)錄［12］。有研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路可刺激缺血心肌細(xì)胞增生，產(chǎn)生良好的心肌保護(hù)效應(yīng)［13］。國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用Notch信號(hào)通路阻斷劑-3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t(yī)-丁酯（DAPT）能抑制原代乳鼠心肌細(xì)胞增殖，促使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡［14］。最新研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號(hào)通路的激活可加快心肌梗死后期心功能的恢復(fù)，對(duì)于缺血性心臟病的治療具有積極的臨床意義［15］。本研究成功構(gòu)建并順利篩選靶向Notch1miRNA的有效干擾質(zhì)粒，為Notch信號(hào)通路對(duì)缺血心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Tien AC，Rajan A，Bellen HJ.A notch updated［J］.J Cell Biol，2009，184（5）：621-629.

［2］Niessen K，Karsan A.Notch signaling in cardiac development［J］.Circ Res，2008，102（10）：1169-1181.

［3］Niessen K，Karsan A.Notch signaling in the developing cardiovascular system［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，293（1）：C1-11.

［4］Nemir M，Pedrazzini T.Functional role of Notch signaling in the developing and postnatal heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45（4）：495-504.

［5］Al Haj Zen A，Madeddu P.Notch signalling in ischaemiainduced angiogenesis［J］.Biochem Soc Trans，2009，37（Pt 6）：1221-1227.

［6］Croquelois A，Domenighetti AA，Nemir M，et al.Control of the adaptive response of the heart to stress via the Notch1receptor pathway［J］.J Exp Med，2008，205（13）：3173-3185.

［7］Urbanek K，Cabral-da-Silva MC，Ide-Iwata N，et al.Inhibition of notch1-dependent cardiomyogenesis leads to a dilated myopathy in the neonatal heart［J］.Circ Res，2010，107（3）：429-441.

［8］Bartel DP.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136（2）：215-233.

［9］Carthew RW，Sontheimer EJ.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs［J］.Cell，2009，136（4）：642-655.

［10］Krol J，Loedige I，F(xiàn)ilipowicz W.The widespread regulation of microRNA biogenesis，function and decay［J］.Nat Rev Genet，2010，11（9）：597-610.

［11］Gregory RI，Chendrimada TP，Cooch N，et al.Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing［J］.Cell，2005，123（4）：631-640.

［12］Wang MM.Notch signaling and Notch signaling modifi-ers［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43（11）：1550-1562.

［13］Gude NA，Emmanuel G，Wu W，et al.Activation of notchmediated protective signaling in the myocardium［J］.Circ Res，2008，102（9）：1025-1035.

［14］楊陽，段維勛，周京軍，等.γ-分泌酶抑制劑對(duì)正常乳鼠心肌細(xì)胞的影響［J］.中國體外循環(huán)雜志，2011，9（2）：89-92.

［15］Li Y，Hiroi Y，Ngoy S，et al.Notch1in bone marrow-derived cells mediates cardiac repair after myocardial infarction［J］.Circulation，2011，123（8）：866-876.