王文衛(wèi)，潘 俊，陳凌武，林煥懿，曾令友

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)泌尿外科，廣東廣州510700；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510080）

有研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌組織中人凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）及結(jié)腸腺瘤性息肉?。ˋPC）基因的啟動子區(qū)域存在高頻率的異常甲基化，為進(jìn)一步揭示Apaf-1及APC基因與膀胱癌的關(guān)系，本研究采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑5-氮-2′-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對膀胱癌細(xì)胞株T24進(jìn)行處理，檢測其Apaf-1及APC基因的甲基化表達(dá)，并分析腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為改變，以探討膀胱癌的發(fā)生機(jī)制并尋求新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 T24人膀胱癌細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所，5-Aza-CdR為Sigma產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) T24人膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素及100mg／mL鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2飽和濕度條件下生長傳代，實(shí)驗(yàn)時取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 藥物處理及分組 5-Aza-CdR按說明書配置溶液。實(shí)驗(yàn)分組：（1）陰性對照組；（2）實(shí)驗(yàn)組再分成4個組，即實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組，待細(xì)胞接種24h后，分別加入0.50、1.00、2.50、5.00μmol／L的5-Aza-CdR。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法測定5-Aza-CdR對細(xì)胞系增殖活性的影響 取對數(shù)生長期 臺盼藍(lán)檢測活力大于95.00%的T24細(xì)胞，以104／孔密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積200μL，細(xì)胞貼壁后以無血清培養(yǎng)基靜止24h，各組均設(shè)3個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，于72h進(jìn)行處理，每孔加入MTT 20μL，37℃、5%CO2繼續(xù)孵育4h，小心吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，充分混勻，于Bio-Tek酶標(biāo)儀分析490nm處吸光度（OD）值。計(jì)算抑制率的公式為：抑制率（%）＝（1-實(shí)驗(yàn)組OD值÷對照組OD值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測T24細(xì)胞周期及凋亡 細(xì)胞同期培養(yǎng)72h后用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶收集處理后的細(xì)胞，800r／min離心10min，沉淀采用300μL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸，逐滴加入700μL預(yù)冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70.00%，4℃避光固定過夜。離心去上清液。PBS洗滌2次。重懸細(xì)胞于500μL含100unit／mL的RNaseA的PBS中，避光，37℃孵育30min。加2.00mg／mL碘化丙啶（PI）至終濃度50.00μg／mL，避光孵育30min。FCM檢測細(xì)胞周期和凋亡率。

1.2.5 引物設(shè)計(jì) Apaf-1的甲基化引物：5′-AGG AAA TTT AAA TTT TCG GGC-3′（F），5′-CGC GAA CGA AAC GTA ACT A-3′（R）；非甲基化引物：5′-GAG GAA ATT TAA ATT TTT GGG T-3′（F），5′-CCA CAA ACA AAA CAT AAC TA-3′（R）。APC的甲基化的引物：5′-TGT TTT ATT GCG GAG TGC-3′（F），5′-AAC CAC ATA TCG ATC ACG TAC-3′（R）；非甲基化引物：5′-TTG TGT TTT ATT GTG GAG TGT-3′（F），5′-AAC CAC ATA TCA ATC ACA TAC ACC-3′（R）。引物設(shè)計(jì)采用Primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)專門軟件，由Invitrogen公司鑒定合成。

1.2.6 甲基化特異性PCR方法（MSP法）檢測膀胱癌T24細(xì)胞株中Apaf-1及APC基因的甲基化狀態(tài) 取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，用0.25%胰酶消化處理，用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒按說明提取基因組DNA，提取的總DNA經(jīng)紫外分光度計(jì)檢驗(yàn)DNA的濃度和純度。將2.00μg DNA加入1.50 mL EP管中并用DDW稀釋至50μL，加5.50μL新鮮配制的3.00mmol／L NaOH，42℃水浴30min使DNA變性；加入新鮮配制的10.00mmol／L氫醌30μL及3.60mol／L亞硫酸氫鈉520μL；50℃避光水浴16h。DNA經(jīng)甲基化修飾處理后純化、回收，-20℃保存。反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液2.50 mL，dNTP 0.50μL，上、下游引物各1.00μL，DNA 1.00μL及2.50U／μL的TaqHS聚合酶0.40μL，加入ddH2O至終體積25.00μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3min、94℃變性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.50%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：僅出現(xiàn)甲基化條帶為高甲基化，同時出現(xiàn)甲基化和非甲基化條帶為半甲基化，僅出現(xiàn)非甲基化條帶為非甲基化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，用±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5-Aza-CdR對細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)可見5-Aza-CdR對T24細(xì)胞生長、增殖活性具有明顯的抑制作用。0.50、1.00、2.50、5.00μmol／L 5-Aza-CdR作用 T24細(xì)胞72h后，細(xì)胞生長抑制率分別為0.50%、5.40%、20.40% 和23.00%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

2.2 5-Aza-CdR對細(xì)胞周期及凋亡的影響 與對照組比較，在1.00 μ - - 作用下T24細(xì)胞G01期的細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例減少（P＜0.05），且隨5-Aza-CdR濃度的增加，阻滯效果更為明顯。實(shí)驗(yàn)組T24細(xì)胞凋亡增 加，5.00μmol／L 5-Aza-CdR 組 凋 亡 率 為 （40.35±3.63）%，與對照組（8.17±1.52）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 5-Aza-CdR對膀胱癌T24細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表1 5-Aza-CdR對膀胱癌T24細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響（±s）

＊：P＜0.05，與陰性對照組比較。

細(xì)胞周期（%）組別G0／G1 S G2／M凋亡率（%）陰性對照組71.30±1.15 25.53±0.25 3.13±1.36 8.17±1.52實(shí)驗(yàn)1組 67.13±0.74＊ 23.87±1.54 9.00±2.29＊ 15.70±2.72＊實(shí)驗(yàn)2組 71.60±1.40 19.40±1.32＊ 9.00±0.44＊ 24.83±3.14＊實(shí)驗(yàn)3組 73.80±1.50＊ 18.13±1.05＊ 8.03±0.40＊ 37.17±1.71＊實(shí)驗(yàn)4組 77.43±0.80＊ 15.20±0.61＊ 7.33±0.51＊ 40.35±3.63＊

2.3 膀胱癌T24細(xì)胞系中Apaf-1及APC基因甲基化狀態(tài)MSP結(jié)果顯示對照組細(xì)胞Apaf-1基因呈半甲基化狀態(tài)，同時出現(xiàn)甲基化和非甲基化條帶，APC基因僅出現(xiàn)甲基化條帶，且呈高甲基化狀態(tài)；而經(jīng)5.00μmol／L 5-Aza-CdR處理后的Apaf-1及APC基因均呈去甲基化狀態(tài)，見圖1、2。

圖1 不同濃度5-Aza-CdR處理T24細(xì)胞后Apaf-1基因甲基化檢測結(jié)果

圖2 不同濃度5-Aza-CdR處理T24細(xì)胞后APC基因甲基化檢測結(jié)果

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用，基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化是導(dǎo)致許多基因去表達(dá)和基因印跡的重要途徑［1-2］。Apaf-1及APC基因是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的多重抑癌基因，Apaf-1是c-myc誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中P53的下游成分，它參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，細(xì)胞色素c／Apaf-1／caspase-9途徑的激活依賴于 Apaf-1［3］。有研究表明，在多種惡性腫瘤中Apaf-1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)，而啟動子甲基化是引起該基因“靜默”的主要原因［4-6］。APC是Wnt信號的下游抑制因子，APC失活后則會導(dǎo)致β-catenin突變而與之解離，細(xì)胞質(zhì)β-catenin轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與Tcf-4結(jié)合，活化靶基因刺激腫瘤生長［7］。本課題的前期研究已證實(shí)Apaf-1、APC基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中所起的重要作用［8-9］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度的5-Aza-CdR作用于T24細(xì)胞系后檢測細(xì)胞的增殖與凋亡，結(jié)果顯示5-Aza-CdR可以明顯抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，細(xì)胞凋亡率明顯提高。0.5μmol／L的5-Aza-CdR對T24細(xì)胞生長已有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，5.0μmol／L 5-Aza-CdR作用T24細(xì)胞72h后，細(xì)胞的生長抑制率達(dá)到23.0%。FCM檢測結(jié)果顯示5-Aza-CdR處理的T24細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞減少，凋亡率達(dá)到（40.35±3.63）%。細(xì)胞凋亡受眾多凋亡相關(guān)基因調(diào)控，具有兩條獨(dú)立的途徑：死亡受體途徑和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，抑癌基因的表達(dá)狀況是癌細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因素。本研究發(fā)現(xiàn)在人膀胱癌T24細(xì)胞系中Apaf-1呈半甲基化狀態(tài)，APC基因的啟動子呈高甲基化狀態(tài)，而5-Aza-CdR作用后的Apaf-1及APC基因均呈去甲基化狀態(tài)。基因啟動子高甲基化或半甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)沉默或降低，是腫瘤發(fā)生的早期事件，而DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化的，5-Aza-CdR抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)其凋亡的作用機(jī)制并非其本身的藥物毒性直接所致，而是其去甲基化的間接作用［10］。5-Aza-CdR通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合，降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生物活性，在DNA復(fù)制過程中可逆轉(zhuǎn)基因CpG島甲基化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而降低甲基化水平，因而被作為去甲基化制劑［11-12］。已經(jīng)證實(shí)5-Aza-CdR在多種腫瘤中具有抑制細(xì)胞增殖和促凋亡作用［13-15］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR能成功逆轉(zhuǎn)兩基因啟動子的甲基化狀態(tài)，使因甲基化失活的Apaf-1及APC基因去甲基化而重新表達(dá)的同時，膀胱癌細(xì)胞出現(xiàn)增殖受限，凋亡明顯增加，這進(jìn)一步說明了Apaf-1、APC基因表達(dá)上調(diào)可能是5-Aza-CdR誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長的重要機(jī)制之一。

通過本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5-Aza-CdR可在體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，提示表觀遺傳學(xué)調(diào)控可能成為膀胱癌治療新的靶點(diǎn)。惡性腫瘤中因基因突變、缺失等遺傳學(xué)改變導(dǎo)致的基因失活難以逆轉(zhuǎn)，而啟動子甲基化所致的基因沉默是可逆的，可通過相應(yīng)藥物逆轉(zhuǎn)表遺傳學(xué)的改變，恢復(fù)抑癌基因的功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療腫瘤的目的。目前，5-Aza-CdR已經(jīng)用于白血病、骨髓增生異常綜合征的臨床治療。因此，如能將5-Aza-CdR與其他干預(yù)藥物聯(lián)合用藥，可能為膀胱癌的治療提供了新的思路。

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