張 芳，于富軍，王艷飛，尹博英

（1.河北大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河北保定071000；2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊050082）

·論 著·

辛伐他汀及缺血預(yù)處理對大鼠缺血再灌注心肌損傷中TNF-α、IL-4的影響

張 芳1，于富軍2，王艷飛1，尹博英1

（1.河北大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河北保定071000；2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊050082）

目的探討辛伐他汀及缺血預(yù)處理對大鼠缺血再灌注心肌損傷中腫瘤壞死因α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）的影響。方法雄性Wistar大鼠72只，隨機分為4組。①假手術(shù)組（Sham，n=9，生理鹽水2mL/d，灌胃5周）；②缺血再灌注組（ischemia and reperfusion，IR，n=21，生理鹽水2mL/d，灌胃5周）；③辛伐他汀預(yù)處理組（simvastatin，Sim，n=21，5mg·kg-1·d-1，灌胃5周）；④缺血預(yù)處理組（ischemia preconditon，IPC，n=21，生理鹽水2mL/d，灌胃5周）。每組又分缺血30min、再灌注30min、再灌注90min 3個時段。分別測定TNF-α、IL-4，比較2種治療方法下TNF-α、IL-4的動態(tài)變化。結(jié)果IR組TNF-α含量均高于Sim組、IPC組，以再灌注30min和再灌注90min差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IR組IL-4含量在再灌注90min時低于Sim組、IPC組中IL-4含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各時間段IPC和Sim預(yù)處理對TNF-α、IL-4的影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論阿托伐他汀或缺血預(yù)處理均可抑制缺血再灌心肌損傷中TNF-α表達，增加IL-4表達，從炎癥水平上證實2種治療方法短期內(nèi)效果無明顯差別。

再灌注損傷；辛伐他??；腫瘤壞死因子α；白細胞介素4

缺血-再灌注損傷心肌在許多危重疾病狀態(tài)如心肌梗死溶栓治療、體外循環(huán)術(shù)、心臟移植是不可避免的。大量動物及臨床試驗均證實缺血預(yù)處理及他汀類藥物干預(yù)均可有效減輕心肌缺血-再灌注損傷，但關(guān)于兩種方法治療后細胞因子變化的比較報道甚少。本研究主要觀察辛伐他汀及缺血預(yù)處理對大鼠缺血再灌注心肌損傷中不同時段腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）的動態(tài)影響。

1 材料與方法

1.1 動物：雄性Wistar大鼠72只，由河北省實驗動物中心提供，體質(zhì)量270～350g。

1.2 動物模型的建立

1.2.1 分組：雄性Wistar大鼠72只，隨機分為4組。對照組（Sham，n=9）；缺血-再灌注組（ischemia reperfusion IR，n=21，生理鹽水2mL/d，灌胃5周），結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支造成心肌缺血30min后再開放；辛伐他汀預(yù)處理組（simvastatin，Sim，n=21，5mg·kg-1·d-1，灌胃5周），手術(shù)操作同IR組；缺血預(yù)適應(yīng)組（ischemia precondition，IPC，n=21，生理鹽水2mL/d，灌胃5周），結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，缺血5min，再灌注5min，反復2次后，缺血5min，再灌注10min，最后行缺血30min后開放。每組又分缺血30min、再灌注30min、再灌注90min 3個時段。

1.2.2 大鼠心肌缺血-再灌注模型的制備：20％烏拉坦1.3mL/100g皮下注射麻醉，記錄肢導心電圖；氣管切開，小動物呼吸機人工呼吸，按2～3mL/100g潮氣量、70～80次/min頻率給予呼氣末持續(xù)正壓通氣，呼吸比為2∶1，壓力5～15cmH2O，根據(jù)呼吸頻率及深度調(diào)整呼吸參數(shù)。于左胸第3～4肋打開胸腔暴露心臟，在左心耳下1mm左冠狀動脈處，用帶5-0絲線不銹鋼圓針穿過心肌淺層，穩(wěn)定10min后將一膠管置于冠狀動脈表面，拉線推管，使膠管壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，用紋式鉗固定10min，放松結(jié)扎線后即行心肌再灌注，其中Sham組不結(jié)扎。

動物模型制備成功標準如下。①缺血時缺血區(qū)心肌顏色變成暗紅色，心肌收縮力明顯減弱；再灌注后心肌顏色變成鮮紅色，心肌收縮力較缺血時增強。②心肌缺血-再灌注過程中伴有心電圖ST段和QRS波振幅和時程的動態(tài)變化。

退出標準如下。①肉眼下觀察，結(jié)合心電圖ST段和QRS波群變化，缺血區(qū)不足心臟質(zhì)量的15％者；②結(jié)扎冠狀動脈左前降支失敗或未發(fā)現(xiàn)再灌注者；③過度出血或心率明顯減慢死亡者；④呼吸、心跳停止超過30s者。

符合以上標準者歸入上述分組，直到每時段動物數(shù)達7只時停止。

1.3 標本采集及指標測定：所有入組的大鼠待造模成功后，自下腔靜脈取血約4mL行TNF-α檢測。取血成功后立即將心臟取出，取部分缺血-再灌注區(qū)心肌組織行IL-4檢測。所有標本均有與組別及時段相對應(yīng)的編號。TNF-α、IL-4應(yīng)用放射免疫測量法定量測定。TNF-α、IL-4試劑盒由解放軍總醫(yī)院科研開發(fā)中心放免所提供。

1.4 統(tǒng)計學方法：應(yīng)用SPSS 11.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，組間比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 TNF-α含量在缺血-再灌注中的變化：同一組中TNF-α含量均隨再灌注時間的延長而遞增。同一時間段，IR組TNF-α含量均高于Sham組、Sim組和IPC組，經(jīng)再灌注30min和再灌注90min時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IPC組和Sim組TNF-α含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 腫瘤壞死因子α的濃度Table 1 The concentration of TNF-α（±s，μg/L）

表1 腫瘤壞死因子α的濃度Table 1 The concentration of TNF-α（±s，μg/L）

*P＜0.05 vs Sham #P＜0.05 vs IR by q testIR：ischemia and reperfusion；Sim：simvastatin；IPC：ischemia preconditon

Groups n TNF-α IR 30min IR 30min IR 90min Sham 9 0.94±0.14 1.02±0.10 1.20±0.02 IR 21 1.25±0.07 1.43±0.11*1.93±0.09*Sim 21 1.23±0.02 1.36±0.09*#1.68±0.13*#IPC 21 1.24±0.04 1.38±0.07*#1.67±0.04*#

2.2 心肌組織中IL-4在缺血-再灌注中的變化：同一組中再灌注心肌組織中IL-4含量隨時間變化增加。同一時間段，IR組IL-4含量低于Sim組和IPC組，高于Sham組，以再灌注90min時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IPC組與Sim組IL-4含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 白細胞介素4的濃度Table 2 The concentration of IL-4（±s，pg/g prot）

表2 白細胞介素4的濃度Table 2 The concentration of IL-4（±s，pg/g prot）

*P＜0.05 vs Sham #P＜0.05 vs IR by q testIR：ischemia and reperfusion；Sim：simvastatin；IPC：ischemia preconditon

Groups n IL-4 IR 30min IR 30min IR 90min Sham 9 44.65±3.02 51.84±2.14 54.42±0.54 IR 21 45.93±9.80 53.83±5.78 69.72±7.35*Sim 21 45.69±9.78 56.71±8.90 80.28±7.85*#IPC 21 45.40±9.02 57.88±8.16 78.02±7.01*#

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是心肌組織在較長時間缺血后恢復血流灌注，反而出現(xiàn)比灌注前更明顯、更嚴重的損傷和功能障礙。心肌缺血再灌注損傷的機制尚未完全闡明，研究［1］表明主要與以下機制有關(guān)，氧自由基、鈣超載、血管內(nèi)皮細胞受損、中性粒細胞激活、炎癥介質(zhì)釋放、基因表達譜改變等。

本研究中發(fā)現(xiàn)IR組、Sim組、IPC組TNF-α、IL-4水平在心肌缺血再灌注后較缺血前升高，均以再灌注90min最為明顯，表明心肌缺血再灌注可引起TNF-α和IL-4升高。心肌缺血再灌注損傷中，氧自由基可激活NF-κB，激活的NF-κB可誘導炎性細胞因子（如TNF-α和IL-6）的釋放，TNF-α合成及分泌增加［2］，加重心肌損傷［3］?，F(xiàn)已將IL-1、IL-6、IL-8及TNF列入炎癥介質(zhì)的范疇，被稱為促炎細胞因子，由Th1細胞分泌。IL-4、IL-10被稱為抗炎細胞因子，有Th2細胞分泌。Th1、Th2分別產(chǎn)生的促炎細胞因子和抗炎細胞因子，在炎癥過程中它們發(fā)揮完全不同的作用。蔣齊勇等［4］研究發(fā)現(xiàn)，將雄性大鼠隨機分成正常對照組、假手術(shù)組和模型組，模型組又分為缺血再灌注3h，5h、24h、3d、7d 5個亞組，以IFN-γ/IL-4比值代表Th1/Th2平衡狀況，發(fā)現(xiàn)模型組fg12表達、Th1/Th2比值均顯著高于正常對照組和假手術(shù)組（P＜0.05），且于再灌注6h達高峰。聶毛曉等［5］研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌缺血再灌注中TNF-α、IL-4表達增加，抑制促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-α的生成，增加抗炎因子IL-4生成，可減輕心肌缺血再灌注損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)Sim組和IPC組TNF-α水平低于IR組，IL-4水平高于IR組，而2組間相比差異無統(tǒng)計學意義。提示辛伐他汀及缺血預(yù)處理均可抑制TNF-α表達，增加IL-4表達。

研究［6］發(fā)現(xiàn)，他汀類可通過抑制白細胞和內(nèi)皮細胞間的相互作用，減少白細胞的滲出，抑制炎癥介質(zhì)的釋放和降低引起組織損傷物質(zhì)的化學活性。王朝暉［7］發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可減少急性缺血-再灌注后心肌和外周血中TNF-α的表達。費愛華等［8］發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可抑制促炎因子TNF-α的生成，增加抗炎因子IL-4生成，對缺血-再灌注心肌損傷起保護作用。這可能與他汀類藥物破壞氧化應(yīng)激，降低還原型輔酶活性，抑制核因子NF-κB、髓過氧化物酶、白細胞的黏附和活性劑炎癥介質(zhì)的表達，上調(diào)抗氧化酶［9］及一氧化氮合酶活性［10］有關(guān)。研究［11-12］發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理，可抑制缺血-再灌注心肌TNF-α表達，可能與抑制NF-κB激活有關(guān)。而多數(shù)學者認為NF-κB的激活是各種炎癥反應(yīng)中炎癥介質(zhì)表達的總開關(guān)和炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)。它活化后能調(diào)控包括TNF-α在內(nèi)的基因的表達，并影響多種病理生理過程。

總之，辛伐他汀及缺血預(yù)處理均可抑制TNF-α表達，增加IL-4表達，減輕缺血再灌注心肌損傷，可能與抑制NF-κB激活有關(guān)，從炎癥水平上證實2種治療方法短期內(nèi)效果差異無統(tǒng)計學意義。隨著對他汀類藥物研究的深入，其作為抗心肌缺血-再灌注損傷的獨特作用必將具有更為廣闊的臨床應(yīng)用前景。

［1］ CORRECH ER，ANDU JAR SA，KUREDLAS RR，et al. Antioxidant and cytotoxic activities of canadine：biological effects and structural aspects［J］.Bioorg Med Chem，2008，16（7）：3641-3651.

［2］ 包怡敏，劉愛華，張志雄，等.銀杏酮酯滴丸預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠心肌組織炎癥相關(guān)細胞因子含量的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學報，2010，4（8）：373-378.

［3］ NIEMANN JT，ROSBOROUGH JP，YOUGQQUIST S，et al. Cardiac function and the proinflammatory cytokine response after recovery from cardiac arrest in swine［J］.J Interferon Cytokine Res，2009，29（11）：749-758.

［4］ 蔣齊勇，王朝暉，劉青松，等.心臟缺血再灌注大鼠Th1/Th2細胞平衡與心臟微血管fgl2表達的相關(guān)性［J］.山東醫(yī)藥，2009，49（25）：20-22.

［5］ 聶毛曉，張雪娟，藤蕾.血脂康預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠炎癥因子影響［J］.青島大學醫(yī)學院學報，2010，46（4）：326-329.

［6］ 王健兵，高曉麗，趙文增，等.阿托伐他汀對不穩(wěn)定型冠心病心絞痛患者冠脈介入術(shù)前后炎性因子的影響［J］.河北醫(yī)科大學學報，2010，31（2）：132-135.

［7］ 王朝暉.不同劑量阿托伐他汀改善大鼠炎癥相關(guān)無復流的前向血流的研究［D］.武漢：華中科技大學同濟醫(yī)學院，2011.

［8］ 費愛華，楊旭峰，陳書艷，等.辛伐他汀預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注的影響［J］.中華實用診斷與治療雜志，2010，24（9）：867-869.

［9］ CHRISTOPHER A，DUPLESSIS，F(xiàn)OTHERGILL D.Investigatingthe potential of statin medications as a nitric oxide（NO）release agent to decrease decompression sickness：a review article［J］. Medical Hypotheses，2008，70：560-566.

［10］ 孫麗爽，張英杰.阿托伐他汀在大鼠急性心肌缺血再灌注中的保護作用及機制［J］.中國心血管病研究雜志，2006，4（12）：929-931.

［11］ 唐白云，陳光獻，劉喜利，等.缺血預(yù)處理通過抑制炎癥反應(yīng)保護心肌細胞［J］.中華實驗外科雜志，2008，25（12）：1618-1620.

［12］ 熊軍，薛富善，袁玉靜，等.缺血預(yù)處理和缺血后處理對大鼠心肌缺血再灌注時炎性反應(yīng)影響的比較［J］.中華麻醉學雜志，2010，30（10）：1182-2285.

（本文編輯：趙麗潔）

EFFECT OF SIMVASTATIN AND ISCHEM IA PRECONDITON ON TNF-α
AND IL-4 IN RATS IN VIVO DURING HEART ISCHEM IA AND REPERFUSION INJURY

ZHANG Fang1，YU Fujun2，WANG Yanfei1，YIN Boying1
（1.Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Hebei University，Hebei Province，Baoding，071000，China；2.Department of Cardiology，Bethune International Peace Hospital of PLA，
Hebei Province，Shijiazhuang 050082，China）

ObjectiveTo study the effect of simvastatin and ischemia preconditon（IPC）on tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-4（IL-4）in rats in vivo during ischemia and reperfusion injury of heart.MethodsSeventy-twomale Wistar rats were random ly divided into four groups：①Sham operated group（n=9，normal saline 2mL/d，5 weeks）；②ischemia and reperfusion（IR）group（n=21，normal saline 2mL/d，5 weeks）；③simvastatin（Sim）group（n=21，simvastatin 5mg·kg-1·d-1，5 weeks）；④ischemic precondition（IPC）group（n=21，normal saline 2mL/d，5 weeks）.Every group was divided into three subunits：post-ischemia for30minutes，reperfusion for 30minutes and 90minutes.After surgical procedures，the levels of TNF-αand IL-4 weremeasured.ResultsThe concentration of TNF-α in IR group was higher than that in Sim group and IPC group，especially at reperfusion for 30 minutes and 90 minute（s P＜0.05）.The concentration of IL-4 in IR group at reperfusion for 90 minutes were lower than that in Sim group and IPC group（P＜0.05）.No differences of the concentration of TNF-αand IL-4 were found in Sim group and IPC group（P＞0.05）.ConclusionBoth of simvastatin and IPC could decrease the concentration of TNF-αand increase the concentration of IL-4 in ischemia and reperfusioninjury of heart.At inflammation level，the two treatments proved no significant difference in short-term effect.

reperfusion injury；simvastatin；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-4

R542.22

A

1007-3205（2013）08-0873-04

2013-01-24；

2013-03-27

張芳（1979-），女，河北保定人，河北大學附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事心血管內(nèi)科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.003