徐艷陽，蔡森森，宋艷翎，李科靜

(吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130022)

響應(yīng)面法優(yōu)化桑白皮甾醇微波輔助提取工藝

徐艷陽，蔡森森，宋艷翎，李科靜

(吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130022)

為優(yōu)化微波輔助提取桑白皮甾醇的工藝，分別考察微波功率、微波時(shí)間、液固比對(duì)桑白皮甾醇得率的影響；采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取工藝，建立各因素與甾醇得率關(guān)系的回歸方程。結(jié)果表明：最佳工藝條件為微波功率539W、微波時(shí)間41s、液固比35:1(mL/g)，此時(shí)甾醇得率為(7.74±0.12)mg/g；實(shí)際值與理論值的相對(duì)誤差為-4.21%，二者基本吻合。與溶劑法、超聲波法相比，微波輔助法的甾醇得率分別提高了1.57%、19.07%，提取時(shí)間大大縮短。

桑白皮；植物甾醇；微波輔助提??；響應(yīng)面；優(yōu)化

桑白皮(Cortex Mori)為?？粕僦参锇咨?Morus alba L.)的干燥根皮，其外表面白色或淡黃白色，是我國衛(wèi)生部于2002年公布的可用于保健食品的中藥之一。其藥理作用主要有利尿、降血壓、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎和降糖等[1]。全世界共有12種?？粕僦参?，中國有9種，在全國各地均有栽培，主要分布于新疆、四川、河北、山東、云南、廣東和東北三省等地。

植物甾醇是結(jié)構(gòu)上類似于膽固醇的植物活性成分，具有降膽固醇、降血脂、抑制腫瘤和抗炎退熱等功效[2-3]。目前經(jīng)過鑒定的植物甾醇單體有250多種[4]，最常見的5種成分是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷和菜油甾烷。2000年美國FDA批準(zhǔn)添加植物甾醇的食品可采用“健康聲稱”標(biāo)簽[5]。2003年歐盟食品科學(xué)委員會(huì)(SCF)亦確證植物甾醇類食品的安全性[5]。然而我國對(duì)植物甾醇的開發(fā)研究很少，2009年國內(nèi)糧油知名品牌金龍魚率先將植物甾醇玉米油引入中國市場，2011年在上海成立的豐益?巴斯夫營養(yǎng)與健康聯(lián)合研究院為植物甾醇的研究與運(yùn)用提供國際性的研討平臺(tái)。因此植物甾醇的研究具有廣闊的市場前景。

目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)桑白皮的研究主要集中在黃酮[6-8]、生物堿[9]等的提取及抗氧化性[10-12]、降糖[13-14]和平喘[15]等方面。對(duì)桑白皮甾醇的研究報(bào)道很少，僅有Piao Shujuan[16]、胡葉梅[17-19]等學(xué)者采用色譜法測定了桑白皮甾醇的含量。微波輔助提取是近年來發(fā)展較快的一種新型提取技術(shù)，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有快速、方便、易操作的優(yōu)點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)桑白皮甾醇的微波提取工藝進(jìn)行研究，為桑白皮甾醇的應(yīng)用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑白皮購于吉林省長春市同仁堂藥店。

β-谷甾醇(分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞95%) 阿拉丁試劑(中國)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DB型超聲波清洗儀 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；MM721AAU-PW微波爐 美的微波電器制造有限公司；LD4-2A型低速離心機(jī) 北京市雷勃爾離心機(jī)有限公司；AL104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；T22N紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑白皮微波提取工藝流程

桑白皮→粉碎→加入0.5mol/L KOH-乙醇溶液→微波輔助提取1次→離心→得到上清液→調(diào)pH值至中性→離心→得到乙醇提取液→測定甾醇含量

1.3.2 甾醇含量的測定

參照文獻(xiàn)[20]的硫磷鐵法測定桑白皮甾醇得率。配制1.0mg/mL β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)稀釋10倍。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL 0.1mg/mL β-谷甾醇溶液，用無水乙醇定容至4.0mL，加入硫磷鐵顯色劑2.0mL，搖勻；15min后在波長530nm處測定其吸光度。以β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1.0mL樣液，用無水乙醇定容至10.0mL，搖勻；從中取2.0mL置于試管中，加入2.0mL無水乙醇，再加2.0mL硫磷鐵顯色劑，搖勻；靜置15min后在波長530nm處測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算樣品中甾醇得率。

式中：y為桑白皮甾醇得率/(mg/g)；c為提取液吸光度對(duì)應(yīng)β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為乙醇提取液體積/mL；b為稀釋倍數(shù)；m為桑白皮質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選擇微波功率、微波時(shí)間、液固比作為試驗(yàn)的單因素。稱取1.0g桑白皮，加入0.5mol/L KOH-乙醇溶液(95%乙醇作溶劑)進(jìn)行微波提取，為防止乙醇過度損失，每次微波10s，間歇10s。4000r/min離心5min，得到上清液，調(diào)pH值至中性，再次4000r/min離心5min得到上清液，采用硫磷鐵法測定甾醇含量。各個(gè)因素的水平分別為：微波功率119、231、385、539、700W；微波時(shí)間10、20、30、40、50s；液固比15:1、20:1、25:1、30:1、35:1(mL/g)。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，其他固定條件分別為微波功率539W、微波時(shí)間40s、液固比25:1(mL/g)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

選擇微波功率(x1)、微波時(shí)間(x2)、液固比(x3)作為考察因素，以甾醇得率作為響應(yīng)值Y，采用中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)(CCD)進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)自然因素水平進(jìn)行編碼(表1)。理論計(jì)算得到微波功率最高值和最低值分別為644、126W，而實(shí)際微波爐最高和最低輸出功率分別為700、119W。因此結(jié)合儀器的實(shí)際條件并參考有關(guān)文獻(xiàn)[21]，選擇因素水平編碼如表1所示。

表1 CCD試驗(yàn)因素水平編碼表Table1 Coded levels for independent variables used in central composite design (CCD)

1.3.5 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

溶劑法：稱取1.0g桑白皮，按液固比35:1加入0.5mol/L KOH-乙醇溶液，采用90℃條件水浴浸提60min，4000r/min離心5min，得到上清液，調(diào)pH值至中性，再次4000r/min離心5min得到上清液，采用硫磷鐵法測定甾醇含量。

超聲法：稱取1.0g桑白皮，按液固比35:1加入0.5mol/L KOH-乙醇溶液，采用超聲功率250W提取60min，檢測步驟同上。

微波法：稱取1.0g桑白皮，按液固比35:1加入0.5mol/L KOH-乙醇溶液，采用微波功率539W提取41s，檢測步驟同上。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel 2003軟件計(jì)算，取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用硫磷鐵法進(jìn)行測定，建立β-谷甾醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=5.467ρ＋0.004，式中：A為吸光度；ρ為β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度/(mg/mL)；該方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9986，說明β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度在0.0125～0.1000mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于定量分析。

2.2 單因素試驗(yàn)及分析

2.2.1 微波功率對(duì)甾醇得率的影響

圖1 微波功率對(duì)甾醇得率的影響Fig.1 Effect of microwave output power on the yield of phytosterol

由圖1可知，當(dāng)微波功率從119～539W，甾醇得率隨微波功率的增大而增加；超過539W后，甾醇得率逐漸下降，原因可能是電磁波將能量直接傳到桑白皮內(nèi)部，在瞬時(shí)加熱的過程中，高溫導(dǎo)致甾醇活性成分破壞。因此選擇微波功率為539W。

2.2.2 微波時(shí)間對(duì)甾醇得率的影響

圖2 微波時(shí)間對(duì)甾醇得率的影響Fig.2 Effect of microwave irradiation time on the yield of phytosterol

2.3 CCD響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取工藝

2.3.1 CCD試驗(yàn)及其結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇微波功率(x1)、微波時(shí)間(x2)、液固比(x3)作為考察因素，以甾醇得率作為響應(yīng)值Y，采用CCD進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。CCD試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由圖2可知，微波時(shí)間在10～40s內(nèi)，甾醇得率隨微波時(shí)間的延長而增加；超過40s以后，甾醇得率增加的幅度不大。因此選擇微波時(shí)間為40s。

表2 CCD試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 CCD scheme and results

2.2.3 液固比對(duì)甾醇得率的影響

圖3 液固比對(duì)甾醇得率的影響Fig.3 Effect of solvent-to-solid ratio on the yield of phytosterol

由圖3可知，當(dāng)液固比在15:1～30:1(mL/g)時(shí)甾醇得率逐漸增加；液固比在30:1～35:1(mL/g)時(shí)甾醇得率趨于平緩。因此選擇液固比30:1(mL/g)。

表3 CCD響應(yīng)面二次模型的方差分析Table3 Analysis of variance for the response surface model

通過響應(yīng)面分析可以得到桑白皮甾醇微波提取工藝的回歸方程為：Y=7.26＋0.86x1＋0.091x2＋0.36x3-

由表3可知，P值為0.0001，決定系數(shù)R2=0.9297，說明該回歸方程的顯著性較好。失擬項(xiàng)P＞0.05，說明該回歸方程不失擬?？梢詰?yīng)用于桑白皮甾醇的微波提取工藝研究。

2.3.2 CCD響應(yīng)曲面圖及其分析

圖4 各兩因素交互作用對(duì)甾醇得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graphs showing the interactive effect of three extraction conditions on the yield of phytosterol

對(duì)回歸方程采用Design Expert 8.0.5軟件分析，獲得因素交互作用的響應(yīng)曲面圖。由圖4可知，最優(yōu)的微波功率范圍應(yīng)在0～1水平(實(shí)際值為385～539W)，最優(yōu)的微波時(shí)間范圍在-1～1水平(實(shí)際值為30～50s)，最優(yōu)的液固比范圍應(yīng)在1～r水平(實(shí)際值為35:1～38:1(mL/g))。通過響應(yīng)面分析，當(dāng)微波功率為539W、微波時(shí)間為41s、液固比為35:1(mL/g)時(shí)，甾醇得率預(yù)測值為8.08mg/g。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2.3.2節(jié)的最優(yōu)工藝參數(shù)微波功率539W、微波時(shí)間41s、液固比35:1(mL/g)，實(shí)際測得甾醇得率為(7.74±0.12)mg/g，與理論值(8.08mg/g)相比，相對(duì)誤差為-4.21%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝參數(shù)是可靠的。2.5 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

采用溶劑法(0.5mol/L KOH-乙醇溶液、液固比35:1(mL/g)、90℃條件水浴)浸提60min，得到甾醇得率為(7.62±0.33)mg/g；采用250W超聲提取20min(0.5mol/L KOH-乙醇溶液、液固比35:1(mL/g))，得到甾醇得率為(6.50±0.05)mg/g。

與溶劑法、超聲輔助法相比，微波輔助法的甾醇得率分別提高了1.57%、19.07%，采用微波輔助法不僅甾醇得率高，而且提取時(shí)間短。

3 結(jié) 論

3.1 以微波功率、微波時(shí)間、液固比為考察因素，以甾醇得率為試驗(yàn)指標(biāo)，通過三因素五水平CCD響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)建立了桑白皮甾醇微波輔助提取的回歸方程(R2=0.9297)：Y=7.26＋0.86x1＋0.091x2＋0.36x3-0.11x1x2＋0.15x1x3＋0.093x2x3-0.45x12-0.55x22-0.11x32。

3.2 通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到桑白皮甾醇微波輔助提取的最佳工藝條件：微波功率539W、微波時(shí)間41s、液固比35:1(mL/g)，此時(shí)甾醇得率為(7.74±0.12)mg/g；實(shí)際測定值與理論預(yù)測值的相對(duì)誤差為-4.21%，實(shí)際值與理論值基本吻合。

3.3 與溶劑法、超聲輔助法相比，微波輔助法的甾醇得率分別提高了1.57%、19.07%，且提取時(shí)間大大縮短。因此微波輔助法是桑白皮甾醇提取的較佳方法。

[1] 馮冰虹, 趙宇紅, 黃建華. 桑白皮的有效成分篩選及其藥理學(xué)研究[J]. 中藥材, 2004, 27(3): 204-205.

[2] 唐傳核. 植物生物活性物質(zhì)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 136-169.

[3] TIKKANEN M J. Plant sterols and stanols[J]. Handbook of Experimental Pharmacology, 2005, 170: 215-230.

[4] 楊振強(qiáng), 謝文磊, 李海濤, 等. 植物甾醇的開發(fā)與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].糧油加工, 2006(1): 53-56.

[5] SUN S, 翟鵬貴, 彭啟輝, 等. 新資源食品原料植物甾醇和植物甾醇酯的安全與應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生監(jiān)督雜志, 2011, 18(1): 51-55.

[6] 李紅娟, 孫居鋒, 代現(xiàn)平, 等. 桑白皮總黃酮超聲波提取法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(3): 1188-1189.

[7] 張國剛, 黎瓊紅, 李樂道, 等. 桑白皮中總黃酮提取工藝研究[J]. 中草藥, 2005, 36(11): 1662; 1727.

[8] JIA Zhishen, TANG Mengcheng, WU Jianming. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals[J]. Food Chemistry, 1999, 64(4): 555-559.

[9] 楊文宇. 中藥桑枝和桑白皮的品種、品質(zhì)與藥效的研究[D]. 成都:成都中醫(yī)藥大學(xué), 2008．

[10] HESHAM A, BESHBISHY E, ABDEL N B, et al. Hypolipidemic and antioxidant effects of Morus alba L. (Egyptian mulberry) root barkfractions supplementation in cholesterol-fed rats[J]. Life Sciences, 2006, 78(23): 2724-2733.

[11] CHANG L W, JUANG L J, WANG B S, et al. Antioxidant and antityrosinase activity of mulberry (Morus alba L.) twigs and root bark[J]. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49(4): 785-790.

[12] DOMINIK K, J?ZEF K, MAGDALENA R, et al. β-Sitosterol and campesterol stabilisation by natural and synthetic antioxidants during heating[J]. Food Chemistry, 2011, 128(4): 937-942.

[13] MA Songtao, ZHANG Xiaoke, WANG Qiulin. Experimental study on the preventive and treat-ment function of Cortex Mori for peripheral ner-vous lesion at the early stage of diabetes rats[J]. Chinese Journal of Applied Physiology, 2008, 24(2): 201-204.

[14] 周峰. 桑白皮總黃酮的提取及其對(duì)糖尿病動(dòng)物作用的初步研究[D].重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué), 2010.

[15] KIM H J, LEE H J, JEONG S J, et al. Cortex Mori Radicis extract exerts antiasth-matic effects via enhancement of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells and inhibition of Th2 cytokines in a mouse asthma model[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 138(1): 40-46.

[16] PIAO Shujuan, CHEN Lixia, KANG Ning, et al. Simultaneous determination of five charact-eristic stilbene glycosides in root bark of Morus albus L. (Cortex Mori) using high-performance liquid chromatography[J]. Phytochemical Analysis, 2011, 22(3): 230-235.

[17] 胡葉梅, 韓軍花, 王素芳, 等. 68種保健食品常用原料植物甾醇含量研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2010, 22(6): 486-489.

[18] 胡葉梅. 我國保健食品常用原料植物甾醇分析方法的建立及應(yīng)用研究[D]. 合肥: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2011.

[19] 胡葉梅, 韓軍花, 王素芳, 等. 中藥降血脂類有效成分: 植物甾醇的含量及分布研究[J]. 衛(wèi)生研究, 2011, 40(3): 388-390.

[20] 劉蕾, 陳星, 李曉麗, 等. 分光光度法測定大豆總甾醇含量的研究[J].中國油脂, 2005, 30(4): 45-46.

[21] 李冠楠. 黑木耳多糖的提取及工業(yè)技術(shù)研究[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2011.

Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Phytosterol from Mulberry Root Bark by Response Surface Methodology

XU Yan-yang，CAI Sen-sen，SONG Yan-ling，LI Ke-jing
(College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130022, China)

This study was undertaken to optimize the microwave-assisted extraction of phytosterol from the root bark of mulberry (Morus alba L.) by response surface methodology. The yield of phytosterol was investigated with respect to three variables including microwave output power, irradiation time and solvent-to-solid ratio. As a result, a regression equation was fitted. The optimal conditions for phytosterol extraction were a solvent-to-solid ratio of 35:1 (mL/g) and microwave irradiation for 41 s with an output power of 539 W. The yield of phytosterol under the optimized conditions was (7.74 ± 0.12) mg/g, showing a relative error of －4.21% compared with the predicted value and increases of 1.57% and 19.07% over those obtained by solvent extraction and ultrasonic-assisted extraction. Moreover, the extraction time was considerably shortened by using microwave-assisted extraction in comparison with the other two methods.

mulberry root bark；phytosterol；microwave-assisted extraction；response surface methodology；optimization

TS201.1

A

1002-6630(2013)18-0065-05

10.7506/spkx1002-6630-201318014

2012-09-07

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20120717)；吉林大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(450060487500；200903263)

徐艷陽(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：xuyy@jlu.edu.cn