李 丹，常紅敏，趙 蕾，邴玉艷，陳曉寧，杜孌英

(承德醫(yī)學院，河北承德 067000)

旋毛蟲小鼠小腸和肌肉組織Caspase-3蛋白表達的研究

李 丹，常紅敏，趙 蕾，邴玉艷，陳曉寧，杜孌英△

(承德醫(yī)學院，河北承德 067000)

目的:觀察旋毛蟲小鼠小腸組織和肌肉組織Caspase-3蛋白表達的變化。方法:建立河南株旋毛蟲感染小鼠模型，取3、5、7d成蟲期小鼠小腸組織，4、5、6w幼蟲期小鼠肌肉組織。采用Western Blot法檢測小鼠小腸組織和肌肉組織Caspase-3蛋白的表達情況。結(jié)果:旋毛蟲成蟲發(fā)育過程中，小鼠小腸組織Caspase-3蛋白的表達隨感染時間的延長升高(P＜0.05);旋毛蟲幼蟲發(fā)育過程中，感染5w小鼠肌肉組織Caspase-3蛋白的表達水平最高(P＜0.05)。結(jié)論:旋毛蟲感染可致小鼠小腸組織和肌肉組織Caspase-3蛋白的表達水平升高，且與感染時間有關(guān)。

旋毛蟲;成蟲;幼蟲;Caspase-3

旋毛形線蟲(Trichinella spiralis)簡稱旋毛蟲，成蟲和幼蟲分別寄生于同一宿主的小腸和肌肉組織，導致的旋毛蟲病(trichinellosis)是一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，呈全球性分布，并被列為三大人獸共患寄生蟲病之首(旋毛蟲病、囊蟲病及棘球蚴病)[1]。近年來，我國已發(fā)生多起旋毛蟲病爆發(fā)流行[2-3]。旋毛蟲成蟲入侵腸壁組織和幼蟲入侵宿主肌肉組織都是其發(fā)育過程中的重要階段，但相關(guān)機制尚不十分清楚。本研究采用Western Blot法檢測旋毛成蟲期小鼠小腸組織、幼蟲期肌肉組織，隨感染時間的延長凋亡因子Caspase-3表達的變化情況，探討旋毛蟲成蟲在小腸內(nèi)寄生、幼蟲侵入肌肉組織時引起侵襲部位的細胞凋亡情況，為研究旋毛蟲病的發(fā)病機制及藥物治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 旋毛蟲株(河南株)由承德醫(yī)學院病原生物學教研室小鼠傳代保種。實驗用昆明雄性健康成年小鼠，體重20-25g，購自承德醫(yī)學院實驗動物中心。主要試劑:胃蛋白酶(1:3000)，上海生工生物工程有限公司;兔抗Caspase-3抗體，美國Sigma公司;β-actin，上?？党缮锕こ逃邢薰?辣根過氧化物酶標記的二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;組織細胞裂解液，江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所;BCA蛋白濃度檢測試劑盒，北京普利萊公司。

1.2 實驗分組 80只小鼠隨機分為A組(成蟲期)和B組(幼蟲期)，每組40只。A組隨機分為感染旋毛蟲3、5、7d組及正常對照組，每組10只;B組隨機分為感染旋毛蟲4、5、6w組及正常對照組，每組10只。

1.3 動物模型的建立[4-5]取河南株保蟲小鼠一只處死，取部分膈肌壓片，鏡下觀察有無旋毛蟲感染，全身骨骼和肌肉稱重，純水沖洗至沒有污血，剪刀剪碎后用組織搗碎機充分搗碎，按1:20的比例加入人工消化液，37℃水浴消化5h，生理鹽水洗滌含旋毛蟲幼蟲的沉淀6次，加入適量4%的明膠溶液充分混勻，取50?l混懸液，鏡下計數(shù)幼蟲，調(diào)整混懸液中的幼蟲密度至200條幼蟲/0.2ml，用于感染昆明小鼠，建立動物模型。

1.4 取材及Western Blot檢測 分別取感染3、5、7d旋毛蟲小鼠十二指腸和感染4、5、6w旋毛蟲小鼠腓腸肌，冰生理鹽水清洗后入液氮速凍，然后移入-80℃冰箱保存。取冷凍保存的小腸和肌肉組織，預冷PBS沖洗2次后，冰浴條件下用細胞裂解液裂解細胞，BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。12%分離膠和5%濃縮膠電泳，蛋白上樣量10μg;4℃轉(zhuǎn)膜2h，5% BSA常溫封閉2h，一抗(1:1000)4℃孵育過夜，二抗(1:5000)搖床孵育1h;加入增強型化學發(fā)光劑(ECL)，X線膠片曝光、顯影和定影。采用Quantity One軟件對顯影條帶進行分析，分別計算Caspase-3條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為目的蛋白的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用(±s)表示，多組間比較行方差分析，以α=0.05為顯著性檢驗的水準。

2 結(jié)果

2.1 旋毛蟲小鼠小腸組織Caspase-3蛋白的表達 旋毛蟲感染各組Caspase-3蛋白的表達均明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。旋毛蟲成蟲發(fā)育過程中，小鼠小腸組織Caspase-3蛋白的表達隨感染時間的延長升高;不同感染時間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1、表1。

圖1 旋毛蟲小鼠小腸組織Caspase-3的表達

表1 旋毛蟲小鼠小腸組織Caspase-3蛋白的表達(±s)

表1 旋毛蟲小鼠小腸組織Caspase-3蛋白的表達(±s)

與正常對照組比較:aP＜0.05;與感染3d組比較:bP＜0.05;與感染5d組比較:cP＜0.05

組別 例數(shù) Caspase-3表達量正常對照組 10 0.793±0.027感染3d 10 0.857±0.025a感染5d 10 1.040±0.018ab感染7d 10 1.344±0.023abc

2.2 旋毛蟲小鼠肌肉組織Caspase-3蛋白的表達 旋毛蟲感染各組Caspase-3蛋白的表達均明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在旋毛蟲幼蟲發(fā)育過程中，感染5w組明顯高于感染4w、6w組，感染6w組明顯高于感染4w組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2、表2。

圖2 旋毛蟲小鼠肌肉組織Caspase-3的表達

表2 旋毛蟲小鼠肌肉組織Caspase-3蛋白的表達(±s)

表2 旋毛蟲小鼠肌肉組織Caspase-3蛋白的表達(±s)

與正常對照組比較:aP＜0.05;與感染4w組比較:bP＜0.05;與感染5w組比較:cP＜0.05

組別 例數(shù) Caspase-3表達量正常對照組 10 0.232±0.023感染4w 10 0.312±0.015a感染5w 10 0.541±0.026ab感染6w 10 0.360±0.035abc

3 討論

旋毛蟲寄生于豬、野豬、鼠、熊等多種動物及人體內(nèi)，因生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲囊包的豬肉或其它動物肉類感染。近年來，旋毛蟲的感染率有增高的趨勢[6]。旋毛蟲成蟲主要寄生于宿主的十二指腸和空腸上段，以腸絨毛為食，蟲體分泌ES產(chǎn)物，引起十二指腸和空腸局部充血、水腫、灶性出血，甚至發(fā)生淺表潰瘍。含幼蟲的囊包則寄生于同一宿主的橫紋肌細胞內(nèi)，幼蟲侵入肌肉時，肌纖維遭到嚴重破壞，表現(xiàn)為肌纖維腫脹、橫紋消失、間質(zhì)有輕度水腫和不同程度的炎性細胞浸潤，包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞。上述發(fā)病機制說明旋毛蟲進入宿主的小腸和肌肉組織可造成組織的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，但并未闡明旋毛蟲成蟲和幼蟲以何種方式造成這些損傷。過去的認識主要局限于旋毛蟲對宿主的機械性損傷，目前已有研究證實細胞凋亡在寄生蟲和宿主相互的作用中具有重要作用，但細胞凋亡在旋毛蟲和宿主相互作用中的研究較少[7-9]。

Caspase家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類半胱氨酸蛋白酶，具有特異酶切天冬氨酸氨基位點的特征，是細胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，一旦被激活，凋亡常難以避免。Caspase-3是介導細胞凋亡的一類蛋白水解酶，在細胞凋亡過程中處于核心位置，凋亡的最后實施通過激活Caspase-3實現(xiàn)，因此,組織內(nèi)Caspase-3表達增多提示有大量的細胞凋亡[10]。本研究結(jié)果顯示，感染旋毛蟲3d、5d和7d的成蟲期小鼠小腸組織Caspase-3的表達逐漸增高，表明成蟲期小鼠小腸組織的凋亡水平隨旋毛蟲感染時間的延長逐漸增加。本研究亦發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲小鼠幼蟲期發(fā)育過程中，第4w、5w時Caspase-3蛋白的表達明顯升高，第6w時Caspase-3蛋白的表達明顯下降。小鼠感染旋毛蟲第4w、第5w幼蟲侵入肌肉初期，幼蟲生長速度快，對肌肉組織的機械性損傷加大，因此細胞凋亡明顯;第6w幼蟲周圍逐漸形成囊包，生長速度變慢，對肌肉組織的損傷亦減小，Caspase-3的表達降低，細胞凋亡有所下降。這一結(jié)果與李繼紅[11]的研究結(jié)果一致。

本研究觀察了旋毛蟲小鼠小腸組織和肌肉組織Caspase-3蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)旋毛蟲成蟲期和幼蟲期生長發(fā)育旺盛階段Caspase-3蛋白的表達水平較高。本研究可為旋毛蟲發(fā)病機制的研究提供實驗基礎(chǔ)，關(guān)于旋毛蟲通過何種途徑誘導細胞凋亡有待進一步研究。

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STUDY ON CASPASE-3 PROTEIN EXPRESSION IN SMALL INTESTIN AND MUSCLE TISSUE OF TRICHINELLA SPIRALIS MICE

LI Dan, CHANG Hong-min, ZHAO Lei, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To observe the changes of Caspase-3 protein in small intestine and muscle tissue of trichinella spiralis mice.Methods:Henan strain trichinella spiralis infected Kunming mice model was established, and Caspase-3 protein expression were detected in small intestine (infected 3d, 5d and 7d) and muscle tissue (infected 4w, 5w and 6w) respectively.Results:With extension of infection time, the expression of Caspase-3 protein in small intestine increasedduring developmental process of trichinella spiralis adult (P＜0.05). The expression of Caspase-3 protein in muscle tissue of infected 5w was the highest during developmental process of trichinella spiralis larvae (P＜0.05).Conclusions:Trichinella spiralis infection can cause increasing of Caspase-3 protein expression in small intestine and muscle tissue of mice, moreover has relations with infection time.

Trichinella spiralis; Adult; Larvae; Caspase-3

S855.9

A

1004-6879(2013)01-0007-03

2012-08-28)

△ 通訊作者