馮晨，馮華，溫宏麗，劉勁睿

塞來昔布對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖及凋亡的影響①

馮晨1a，馮華1b，溫宏麗1c，劉勁睿2

目的探討非甾體類抗炎藥(NSAIDs)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。方法選用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，分別加入0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的塞來昔布進(jìn)行處理。四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法檢測U251細(xì)胞增殖水平及抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果隨塞來昔布濃度的增加，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖水平明顯降低，增值抑制率升高。不同濃度和不同作用時(shí)間，塞來昔布對(duì)U251細(xì)胞增殖抑制率有顯著性差異(P＜0.05)；流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡率檢測顯示，80 μmol/L塞來昔布處理48 h的U251細(xì)胞凋亡率(17.86%)較0 μmol/L(11.23%)增高(P＜0.05)。結(jié)論塞來昔布可抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的生長和增殖，促進(jìn)U251的凋亡發(fā)生，以80 μmol/L為佳。

膠質(zhì)瘤；U251細(xì)胞；塞來昔布；增殖；凋亡

[本文著錄格式]馮晨，馮華，溫宏麗，等.塞來昔布對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖及凋亡的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2013,19(6):532-535.

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，是高度血管化的血管生成依賴性生長的人類腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率和病死率均為最高，是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的主要疾病之一[1-4]。近年來的研究表明，非甾體抗炎藥(non-steroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)的應(yīng)用與癌癥危險(xiǎn)性的降低之間有著顯著相關(guān)性，NSAIDs這種抑制惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用主要與抑制環(huán)氧化酶-2(cycloxygenase-2,Cox-2)的活性有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成員在惡性腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。本研究檢測體外塞來昔布干預(yù)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖活性、凋亡發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251：哈爾濱醫(yī)科第四附屬醫(yī)院腦外科饋贈(zèng)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、聚氧乙烯醚類(Triton X)-100、青/鏈霉素、胰蛋白酶及塞來昔布：美國SIGMA公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)：美國Amresco公司。

1.2 標(biāo)本的留取

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的傳代培養(yǎng)：①細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞鋪滿單層后，在無菌操作臺(tái)上將舊培養(yǎng)液從培養(yǎng)瓶中倒出，吸取已高壓滅菌的PBS液2 ml清洗細(xì)胞，棄去，然后加入0.5%胰酶1 ml，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況；②約5 min，細(xì)胞開始固縮變圓，細(xì)胞間隙增大，見少許細(xì)胞漂浮起來，此時(shí)，迅速向培養(yǎng)瓶中加入含(10%FBS、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)液2 ml終止消化，吹打成細(xì)胞懸液，再將其轉(zhuǎn)入離心管中離心(1000 r/min,3 min)，棄上清；③向離心管中加入2 ml DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，分裝至培養(yǎng)瓶中，通常1瓶可分裝為2瓶，然后向培養(yǎng)瓶中加入6 ml新的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)；④細(xì)胞2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的80%左右時(shí)便可進(jìn)行傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

1.3.1 MTT檢測細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照5000個(gè)細(xì)胞/孔，接種于96孔板，每孔200 μl(細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入用DMSO溶解的不同濃度的塞來昔布(0、10、20、40、80 μmol/L)，以不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)液的平行孔作為空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。每個(gè)濃度分別測量3個(gè)復(fù)孔，每孔加入20 μl MTT后，將孔板放入CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心將培養(yǎng)液吸出，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測量每孔在570 nm處的光密度(OD)值(以實(shí)驗(yàn)孔OD值減去空白對(duì)照的OD值為其結(jié)果)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率 選用Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit檢測細(xì)胞凋亡率。用不含EDTA的胰酶消化收集處于對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞2次(2000 r/min離心5 min)，收集1.0×106細(xì)胞；加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-APC，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；在1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 U251細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 U251細(xì)胞體外培養(yǎng)情況 U251細(xì)胞貼壁生長，呈單層排列，細(xì)胞排列緊密，分界清楚，呈多形性，以梭形為主，細(xì)胞可發(fā)出突觸，培養(yǎng)2～3 d后，細(xì)胞長滿瓶底的80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

2.1.2 不同濃度塞來昔布干預(yù)后對(duì)U251細(xì)胞的影響

加入塞來昔布48 h后，倒置顯微鏡下觀察可見：①空白對(duì)照組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)呈典型的膠質(zhì)瘤形態(tài)，細(xì)胞核規(guī)則，胞漿無明顯改變，核仁明顯；②用藥10 μmol/L 48 h的膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)異形細(xì)胞，細(xì)胞膜有不規(guī)則突起，部分細(xì)胞變?。虎塾盟?0 μmol/L 48 h的膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量有所減少，部分細(xì)胞縮小，細(xì)胞膜不規(guī)則突起增多；④用藥40 μmol/L 48 h的膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目明顯減少，大部分細(xì)胞縮小，變形細(xì)胞增多，有不規(guī)則突起的細(xì)胞增多；⑤用藥80 μmol/L 48 h異形細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核仁不明顯，脫落細(xì)胞增多，細(xì)胞分裂相減少。見圖1。

2.2 MTT檢測細(xì)胞增值情況

80 μmol/L塞來昔布對(duì)U251細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于0 μmol/L塞來昔布的抑制作用(P＜0.01)。見表1。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測塞來昔布干預(yù)前后人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的凋亡率

80 μmol/L塞來昔布處理48 h的U251細(xì)胞凋亡率(17.86%)較未處理(11.23%)增高(P＜0.05)。見圖2。

表1 塞來昔布對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞活性的影響(OD值)

圖1 不同濃度塞來昔布干預(yù)后對(duì)U251細(xì)胞的影響(100×)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測塞來昔布干預(yù)前后人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的凋亡率

3 討論

由于膠質(zhì)瘤多呈侵潤性生長，增殖速度快，外科手術(shù)難以做到全切，術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，是制約臨床治療效果的重要因素。本研究所選用的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和人體真實(shí)的膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性有很強(qiáng)相似性，通常作為研究膠質(zhì)瘤最常用的細(xì)胞株。以塞來昔布為代表的Cox-2選擇性抑制劑，具有低毒性、胃腸道副作用小、長期服用耐受性好等特點(diǎn)。

NSAIDs抗腫瘤的機(jī)制目前尚未明確。NSAIDs作為經(jīng)典的Cox-2抑制劑，除了有明顯的消炎作用外，其機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)非Cox-2依賴性機(jī)制。①促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡：阿司匹林可以通過抑制核因子κB (NF-κB)途徑來促進(jìn)凋亡；激活過氧化酶體增殖激動(dòng)劑受體(PPAR)γ促進(jìn)凋亡；②增加傳統(tǒng)化療藥的療效；③NSAIDs激活RECK基因高表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物抑制至少三種基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP，MMP-2及MMP-9)，進(jìn)而抑制腫瘤的血管形成及轉(zhuǎn)移。

有實(shí)驗(yàn)證明，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中Cox-2和MMP-2均高表達(dá)，且Cox-2與膠質(zhì)瘤的遷移侵襲相關(guān)[5]。為了進(jìn)一步明確塞來昔布對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖抑制效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了不同藥物濃度和作用時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)不同濃度塞來昔布作用后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)和貼壁能力隨時(shí)間發(fā)生相應(yīng)的變化，發(fā)生形態(tài)學(xué)變化及貼壁能力下降的細(xì)胞比例隨藥物作用時(shí)間的延長和藥物濃度的增加而明顯增加；未經(jīng)塞來昔布作用的對(duì)照組細(xì)胞分裂增殖旺盛，細(xì)胞呈梭形貼壁生長。塞來昔布對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251有極為明顯的抑制作用，其抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴性。隨著塞來昔布濃度的增加，細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，并且可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生，體現(xiàn)了塞來昔布具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖和促進(jìn)其凋亡的作用，其機(jī)制可能是塞來昔布通過抑制Cox-2，進(jìn)而上調(diào)U251細(xì)胞中P53的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的生長，達(dá)到抗腫瘤的效果有關(guān)，但這方面的結(jié)論還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。臨床研究表明，大劑量且長時(shí)間使用塞來昔布能增加心血管不良事件的發(fā)生[6]，因此，將塞來昔布在安全劑量范圍內(nèi)對(duì)腫瘤進(jìn)行臨床治療，還需要更多研究來證實(shí)。

[1]陳金緒,李建安,陳月鑫.巢蛋白和血管內(nèi)皮生長因子在腦膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2011,27(6): 685-688.

[2]范存剛,周景儒,張慶俊.間充質(zhì)干細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)性靶向治療中的應(yīng)用[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2010,37 (1):22-25.

[3]蘇偉,劉福生,朱貴東,等.人腦膠質(zhì)瘤中轉(zhuǎn)化生長因子β2、Smad3蛋白表達(dá)及臨床意義[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2011, 17(5):433-436.

[4]劉柏麟,章翔.膠質(zhì)細(xì)胞瘤的侵襲機(jī)制及分子靶向治療研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2007,6(6):568-570.

[5]Lu DY,Leung YM,Huang SM,et al.Bradykinin-induced cell migration and COX-2 production mediated by the bradykinin B1 receptor in glioma cells[J].J Cell Biochem,2010,110(1): 141-150.

[6]Arber N.Cyclooxygenase-2 inhibitors in colorectal cancer prevention:point[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2008,17 (8):1852-1857.

Effect of Celecoxib on Proliferation and Apoptosis of U251 Glioma Cells

FENG Chen,FENG Hua,WEN Hong-li,et al.Department of Neurosurgery,Mudanjiang Medical University,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China

ObjectiveTo explore the effect of celecoxib on proliferation and apoptosis of the glioma cells.MethodsThe glioma cell U251 was used and disposed with different densities of celecoxib(0 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L and 80 μmol/L)for 24 h,48 h and 72 h.The methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was used to detect the tumor cell proliferation and flow cytometry was used to detect the tumor cell apoptosis rate.ResultsThe Glioma U251 cells proliferation were significantly decreased with the increase of density of celecoxib in vitro,and there was significant difference in the inhibited rate in different density and different time(P＜0.05).The apoptosis rate was higher in the density of 80 μmol/L(17.86%)than in that of 0 μmol/L(11.23%)(P＜0.05).ConclusionCelecoxib can inhabit the proliferation of glioma U251 cells,and promote the apoptosis especially with the density of 80 μmol/L.

glioma;U251 cell;celecoxib;proliferation;apoptosis

R730.2

A

1006-9771(2013)06-0532-04

黑龍江省研究生創(chuàng)新科研資金項(xiàng)目(No.YJSCX2011-386HLJ)。

2013-03-01

2013-04-19)

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，a：紅旗醫(yī)院普外科；b：病理生理學(xué)教研室；c：外語教研室，黑龍江牡丹江市157011；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江佳木斯市154002。作者簡介：馮晨(1984-)，男，漢族，黑龍江牡丹江市人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：腫瘤發(fā)病機(jī)制。通訊作者：劉勁睿(1967-)，男，漢族，黑龍江佳木斯市人，碩士，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向：腦缺血對(duì)記憶的影響。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.06.009