安 明，劉 金，馮晶晶，孟 婧

（1.保定市第一中心醫(yī)院 骨科，河北保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 婦科，河北保定 071000）

交叉韌帶是保持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的最重要的結(jié)構(gòu)，一旦損傷難以自愈，常常需要手術(shù)重建交叉韌帶，但由于骨-腱的愈合遠(yuǎn)比骨-骨的愈合要慢，主要原因是骨-腱愈合不良，所以如何促進骨-腱愈合是目前臨床研究的熱點。本文將骨保護素（osteoprotegerin，OPG）加入前交叉韌帶重建動物模型中，觀察不同時期骨-腱的愈合情況，旨在為臨床提供促進骨-腱愈合新的治療方法。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取24只成年新西蘭白兔，購于河北大學(xué)動物實驗中心，雌雄不限。OPG購于上海希美生物科技有限公司。

1.2 模型制作及分組

將24只新西蘭白兔編號，隨機分為2組，每組12只。A組于骨腱結(jié)合面間注入骨保護素，B組為空白對照組。

1.3 標(biāo)本處理及檢測方法

模型的制備：實驗兔采用質(zhì)量濃度為0.6%戊巴比妥鈉2ml/kg體重靜脈全麻。在實驗兔后腿做一長約3cm的膝正中切口，充分暴露前交叉韌帶并完全切除。在脛骨和股骨上各打一條直徑2.0mm的骨隧道。然后分離股骨內(nèi)側(cè)肌群找到半腱肌并于肌腱與肌腹交界處切斷，修整半腱肌肌腱并將其自內(nèi)側(cè)副韌帶的淺層穿經(jīng)脛骨及股骨隧道，于屈膝位拉緊，最終縫合于外側(cè)副韌帶上。對側(cè)關(guān)節(jié)做相同處理。A組膝關(guān)節(jié)股骨及脛骨骨隧道內(nèi)分別注入濃度為50ng/ml骨保護素0.15ml，B組膝關(guān)節(jié)內(nèi)不注入任何物質(zhì)。沖洗關(guān)節(jié)腔及手術(shù)切口，逐層縫合，敷料包扎。術(shù)后允許兔在籠中活動。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況

觀察術(shù)后動物飲食、關(guān)節(jié)活動及傷口愈合情況。

1.4.2 組織學(xué)觀察

分別于術(shù)后3周，6周和12周末每組各處死2只實驗動物，并于膝關(guān)節(jié)上3cm截斷股骨，膝關(guān)節(jié)下3cm截斷脛骨后取得完整膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)體積濃度為10%甲醛水溶液固定72h后，脫鈣72h（體積濃度45%的鹽酸45ml，體積濃度55%甲酸55ml加蒸餾水450ml構(gòu)成脫鈣液），常規(guī)沖水、脫水、浸漬、包埋、切片，HE染色。光鏡下觀察，主要觀察骨-腱愈合情況。

1.4.3 生物力學(xué)檢測

分別于術(shù)后3周、6周和12周末每組各處死2只實驗動物，并于膝關(guān)節(jié)上4cm截斷股骨，膝關(guān)節(jié)下4cm截斷脛骨后取得完整膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，離斷膝關(guān)節(jié)標(biāo)本上除前交叉韌帶外的所有組織聯(lián)結(jié)，離斷后將脛骨及股骨端分別固定于力學(xué)試驗儀牽拉臺兩端，以5.0mm/s的拉力進行牽拉試驗至肌腱從骨隧道中脫出，并記錄肌腱從骨隧道中脫出時的加載負(fù)荷。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包。計量資料組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)變化

術(shù)后3周（圖1、2，封底）：A組的骨隧道與肌腱結(jié)合面間可見軟骨細(xì)胞并逐漸鈣化成骨，原有骨小梁周圍有大量成骨細(xì)胞增生。B組顯示移植腱周圍僅有大量細(xì)胞外膠原纖維生成，呈不規(guī)則結(jié)構(gòu)，偶爾可見膠原纖維與骨隧道的連接。術(shù)后6周標(biāo)本（圖3、4，封底）：A組的結(jié)合面間有部分新骨生成，組織中含有部分成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。B組的骨隧道與肌腱結(jié)合面可見新骨生成，組織中含有較多成骨細(xì)胞，移植腱與新生骨部分形成纖維軟骨連接。術(shù)后12周標(biāo)本（圖5、6，封底）：A組的骨隧道與肌腱結(jié)合面間幾乎全部有新骨生成，骨-腱間呈連續(xù)性纖維軟骨連接，形成類似正常的韌帶止點結(jié)構(gòu)。B組的骨隧道與肌腱結(jié)合面間僅見少量新骨的生成，骨-腱結(jié)合面間可見部分肌腱與周圍骨組織呈纖維軟骨連接。

表1 3周、6周及12周時2組的生物力學(xué)試驗結(jié)果（xˉ±s，N）

2.2 生物力學(xué)試驗結(jié)果

表1示第3周時，2組的力學(xué)結(jié)果分別為15.03±1.57N、13.99±1.40N，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。第6周時，2組的力學(xué)結(jié)果分別為23.92±1.24N、16.42±1.53N，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。第12周時，2組的生物力學(xué)結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。

3 討論

骨保護素（OPG）主要作用是影響骨代謝，可抑制破骨細(xì)胞的發(fā)生，并促進破骨細(xì)胞的凋亡，所以又被稱為破骨細(xì)胞抑制因子[1，2]。OPG在骨代謝過程中具有極其重要的生物學(xué)功能[3]，闡明它在骨代謝過程中的作用和功能，有望為骨質(zhì)疏松、韌帶重建等多方面的治療提供新的思路。

OPG在人體內(nèi)的平均濃度為0.5～5.0μg/l[4，5]，本實驗參照人體內(nèi)的濃度范圍，觀察不同時期OPG對骨腱愈合的作用。通過本研究發(fā)現(xiàn)，3周時前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）全部斷裂時拉伸力量在2組無顯著性差異（P＞0.05），免疫組化圖片上顯示二組骨隧道與肌腱結(jié)合面間有少量纖維組織增生，形成薄層纖維組織，試驗組有少量成骨細(xì)胞。也就是說早期OPG未與隧道壁形成穩(wěn)定的連接。6周時ACL全部斷裂時拉伸力量在A組與B組有顯著性差異（P＜0.05），表明試驗組骨-腱愈合更牢固。在6周以后免疫組化圖片上顯示：A組和B組韌帶止點周圍結(jié)締組織和骨增生明顯，并在韌帶與骨之間出現(xiàn)類似末端結(jié)構(gòu)樣連接，骨隧道與肌腱結(jié)合面有大量新骨生成，組織中含有大量成骨細(xì)胞，移植腱與新生骨緊密結(jié)合形成纖維軟骨連接。從而認(rèn)為OPG可通過誘導(dǎo)新骨生成、促進纖維結(jié)締組織的生成來促進韌帶與骨之間的早期牢固愈合[6]。12周時，A組、B組均形成連續(xù)性纖維軟骨連接，形成類似正常的韌帶止點結(jié)構(gòu)。ACL全部斷裂時拉伸力量在A組與B組有顯著性差異（P＜0.05），這一結(jié)果提示：OPG成骨作用最為明顯[7]。

OPG作為重要的骨代謝相關(guān)因子日益得到廣泛的應(yīng)用，在今后的實驗中，我們將在不同時間段或加入不同濃度的OPG，為其早日在臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[1]田虹，樊瑜波.OPG、RANK、RANKL的結(jié)構(gòu)、作用機制和在骨疾病中的作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2010，20：67-68.

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[3]Belibasakis GN，Bostanci N.The RANKL-OPG system in clinical periodontology[J].J Clin Periodontol，2011，24：10.

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