周玲艷，劉勝洪，秦華明，黎佩鳳，楊鳳婷，趙 鋼

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院生命科學學院，廣東 廣州 510225； 2.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510623)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上最主要的栽培面積最廣的優(yōu)良豆科牧草之一，以“牧草之王”著稱，在草田輪作、植被恢復和家畜養(yǎng)殖等方面發(fā)揮著重要作用[1]。但苜蓿生育期需水較多，每形成1 g干物質(zhì)需水700～800 g，田間需水量達5 855 m3·hm-2。而我國苜蓿主栽區(qū)干旱缺水，嚴重制約著苜蓿的大面積推廣，因此，對苜蓿的抗旱性研究顯得尤為重要。在過去幾十年里，對苜蓿的抗旱性研究取得了很多成果，研究內(nèi)容從抗旱性的鑒定方面逐步轉(zhuǎn)移到提高苜蓿自身抗旱性的研究上來。目前，苜?？购敌杂N方面的研究已經(jīng)成為該領域的主要研究方向。

植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋于植物表皮角質(zhì)層上的一層可見的蠟狀隆起，在通過調(diào)控植物表皮滲透性、限制非氣孔性水分喪失以抵御水分脅迫方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。張志飛等[5]發(fā)現(xiàn)高羊茅(Festucaelata)葉片表皮蠟質(zhì)可通過對氣孔導度的調(diào)節(jié)來減少氣孔蒸騰，提高水分利用效率，最終提高其抗旱性。張正斌和山侖[4]研究表明，蠟質(zhì)含量與蒸騰速率呈顯著正相關。Vogg等[6]在對番茄(Lycopersiconesculentum)蠟質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)表皮蠟質(zhì)起著蒸騰屏障的作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7-8]、水稻(Oryzasativa)[9]以及細莖冰草(Elymustrachycaulum)[10]中也均發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)含量與植物抗干旱能力呈正相關。也有研究者認為，角質(zhì)層蠟質(zhì)組成[11-15]以及蠟質(zhì)結構[16]是決定植物抗旱性的關鍵。Oliveira等[11]認為，植物表皮水分滲透性與蠟質(zhì)成分的極性有關，低極性物質(zhì)能更有效的防止水分散失。但有關蠟質(zhì)晶體結構與葉水分散失過程之間的關系還有待進一步研究。

紫花苜蓿在逆境脅迫下可通過葉表皮蠟質(zhì)含量、成分或結構的改變而提高抗逆性[10，17-19]，轉(zhuǎn)基因苜蓿蠟質(zhì)含量與抗干旱能力同樣呈正相關[20-21]。而不同品種之間蠟質(zhì)含量差異與抗旱性之間的關系尚未見報道。本研究以5個苜蓿品種為材料，分析苜蓿葉表面蠟質(zhì)覆蓋量以及抗性生理指標，旨在探討不同苜蓿品種葉片蠟質(zhì)覆蓋量與抗旱性的關系，為選育抗旱苜蓿品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 阿爾岡金、大富豪、WL525、苜蓿王和WL2321共5個苜蓿品種。材料種植地為廣州市仲愷農(nóng)業(yè)工程學院鐘村實驗場溫室大棚。苜蓿種子經(jīng)2% NaClO消毒后，在培養(yǎng)皿中發(fā)芽，挑取生長狀態(tài)一致的健康小苗種植于溫室大棚中，種植土壤質(zhì)地為壤土，定期澆水。自然光照，溫度為20～28 ℃，相對濕度為70%～90%。待苜蓿植株生長兩個月后，取不同苜蓿品種葉進行各項指標的測定。

1.2試驗方法

1.2.1不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)掃描電鏡分析和含量測定 自植株上部采集第2片展開葉片，從葉中間沿葉脈切割，分正反兩面，距中間葉脈 0.1 cm 處剪取樣品進行掃描電鏡觀察，葉片表面蠟質(zhì)掃描電鏡分析的材料處理和制作參照周玲艷等[22]的方法，每個苜蓿品種分別取3枚葉片進行正反面表面蠟質(zhì)掃描電鏡觀察。葉片蠟質(zhì)提取參照周小云等[23]的方法，采用稱重法計算葉面積，每個苜蓿品種重復測定3次，取其平均值。

1.2.2不同苜蓿品種葉片葉綠素浸提率的測定 取1.5 g苜蓿葉片并剪碎至約3 cm長，浸泡在30 mL 80%的乙醇中，黑暗條件下輕輕搖晃，分別于20、40、50、60、90、120和210 min取3 mL浸提液用于測定其在λ664和λ647波長下的吸收值，每次測定后的浸提液倒回相應的瓶中，每個品種各做3個重復。

葉綠素浸提量(mmol·g-1)=7.93A664+19.53A647；

葉綠素浸提率=(不同浸體時間的葉綠素浸提量/210 min時的葉綠素浸提量)×100%。

式中，不同浸體時間分別為20、40、50、60、90、120 min。

1.2.3脯氨酸含量測定 脯氨酸含量采用酸性水合茚酸酮法[24]測定。

1.2.4PEG模擬干旱處理 取不同苜蓿品種枝條插于質(zhì)量分數(shù)為20% 的PEG-6000溶液中，25 ℃恒溫，光照強度為100～150 μmol·m-2·s-1，光照時間為14 h·d-1，觀察不同苜蓿品種生長狀態(tài)，并于處理36 h時進行拍照，重復3次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0及Excel 2003進行分析處理。顯著水平為P<0.05(Dunman法)。

2 結果

2.1不同苜蓿品種葉片表面蠟質(zhì)晶體的掃描電鏡觀察 為了考察不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)分布情況，本試驗采用掃描電鏡觀察苜蓿葉片。結果表明，苜蓿王和阿爾岡金葉片蠟質(zhì)片狀結構大而密集；大富豪蠟質(zhì)片狀結構也大，但較稀疏；WL2321和WL525葉片蠟質(zhì)片狀結構小而稀疏(圖1)。

2.2不同苜蓿品種葉蠟質(zhì)含量測定 5個苜蓿品種中，苜蓿王的葉表面蠟質(zhì)含量最高，為0.539 mg·cm-2，大富豪、阿爾岡金和WL2321葉表面蠟質(zhì)含量相差不大，約為0.50 mg·cm-2，而WL525的葉表面蠟質(zhì)含量最低，只有0.402 mg·cm-2。苜蓿王與WL525葉表面蠟質(zhì)含量相差顯著(P<0.05)(表1)。

2.3不同苜蓿品種葉片的葉綠素浸提率測定 隨浸提時間的增加，各苜蓿品種的葉綠素浸提率增加(圖2)。在浸提初期，苜蓿王葉綠素浸提速率較快，但到60 min以后，其葉綠素浸提速率相對其他品種明顯減慢。在5個苜蓿品種中，WL525的葉綠素浸提率在不同時間段一直最大，且在90 min以內(nèi)，大富豪與WL525葉片的葉綠素浸提速率差異顯著(P<0.05)。

2.4不同苜蓿品種葉片的脯氨酸含量測定 脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗旱性方面有著積極作用。不同苜蓿品種間的脯氨酸含量差異顯著(P<0.05)，苜蓿王的脯氨酸含量最高，為231.2 μg·g-1，其次是大富豪，為108.7 μg·g-1，再次為阿爾金剛和WL2321分別為72.9和60.9 μg·g-1，而WL525的脯氨酸含量最低，只有35.7 μg·g-1(表1)。

2.5不同苜蓿品種的PEG模擬干旱處理 對不同苜蓿品種的蠟質(zhì)覆蓋量和生理特性的分析表明，不同苜蓿品種之間存在著差異，而表面蠟質(zhì)在防止水分散失中起著非常重要的作用，可能與苜蓿植株的抗旱性有關。本研究取不同苜蓿品種枝條扦插于質(zhì)量分數(shù)為20% 的PEG-6000溶液中進行模擬干旱處理，結果表明，苜蓿王萎蔫程度最低(圖3)，說明苜蓿品種抗旱能力增強可能與植株葉片蠟質(zhì)覆蓋量增加有關。

3 討論與結論

植物表皮蠟質(zhì)層是植物自我防護的第一道屏障，對調(diào)控表皮滲透性、減少非氣孔性水分喪失等起著重要作用[3-4]。Weng等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥lacs1lacs2雙缺失突變體的葉綠素浸提率是野生型的4倍，失水率也比野生型高，對干旱更為敏感。Seo等[13]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥MYB96轉(zhuǎn)錄因子突變體葉表面蠟質(zhì)含量與葉綠素浸提率和角質(zhì)蒸騰呈正相關。Leide等[14]的研究表明，番茄ps突變體果實表面失水率比對照快5～8倍。Vogg等[6]在對番茄蠟質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)組成，特別是內(nèi)表皮蠟質(zhì)起著蒸騰屏障的作用。郭彥軍等[19]在對苜蓿進行水分脅迫處理試驗中發(fā)現(xiàn)，強抗旱植株葉面蠟質(zhì)含量明顯高于弱抗旱植株，說明葉表皮蠟質(zhì)可能參與了控制水分散失的過程。本試驗掃描電鏡結果顯示，苜蓿葉表皮存在致密蠟質(zhì)層，蠟質(zhì)晶體結構呈片狀或梅花狀。掃描電鏡和蠟質(zhì)含量測定結果表明，不同品種苜蓿葉表面蠟質(zhì)含量不同，其中，苜蓿王的葉表面蠟質(zhì)分布較密集，蠟質(zhì)含量較高，而WL525葉表面蠟質(zhì)分布較稀疏，蠟質(zhì)含量較少。葉綠素浸提速率試驗表明，苜蓿王葉片在浸提后期葉綠素浸提速率相對其他品種明顯較慢，而WL525的葉綠素浸提率在不同時間段一直最大，說明不同苜蓿品種葉片表面蠟質(zhì)覆蓋與表皮滲透性呈正相關，可能參與調(diào)控水分的非氣孔性喪失。

圖1 不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)晶體結構掃描電鏡觀察Fig.1 Scanning electron microscopy analysis on structure of leaf epicuticular wax crystals of different alfalfa varieties

表1 不同苜蓿品種葉表面蠟質(zhì)含量和脯氨酸含量測定Table 1 The total contents of leaf epicuticular wax and proline of different alfalfa varieties

張志飛等[5]認為，表皮蠟質(zhì)含量可以作為高羊茅品種抗旱性鑒定的一個新指標。表皮蠟質(zhì)含量對抗旱性的積極作用在其他多種植物的研究中已得到驗證，如Bourdenx等[8]在過表達擬南芥蠟質(zhì)合成相關基因CER1研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CaMV35S::CER1擬南芥植株角質(zhì)層通透性比野生型和突變體的低，對干旱脅迫有更強的耐受力。Islam等[9]通過對蠟質(zhì)合成相關基因OsGL1-2的過表達發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)的積累可增強水稻對干旱的抗性。Zhang等[20]將豆科植物的一個轉(zhuǎn)錄因子WXP1基因轉(zhuǎn)入苜蓿中，轉(zhuǎn)基因植株葉單位面積的蠟質(zhì)含量增加，抗旱性提高，而WXP1及WXP2轉(zhuǎn)化擬南芥同樣提高了其蠟質(zhì)含量和抗水分脅迫的能力[21]。本研究通過質(zhì)量分數(shù)為20% 的PEG-6000溶液進行模擬干旱脅迫，結果表明，蠟質(zhì)含量最高的苜蓿王對干旱的敏感性最弱，說明苜?？赡芡ㄟ^蠟質(zhì)層的增厚而減少蒸騰來限制水分散失，增強植株抗旱能力。

圖2 不同苜蓿品種的葉綠素浸提率分析Fig.2 The Chlorophyll leaching assays of mature leaves from different alfalfa varietiess

圖3 不同苜蓿品種的PEG模擬干旱處理Fig.3 The simulated drought treatment of different alfalfa varieties

植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸[26]。逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸積累量與抗旱性呈正相關[19,26-27]。本研究對5個苜蓿品種葉片脯氨酸含量測定表明，苜蓿王葉片脯氨酸含量最高，而WL525葉片脯氨酸含量最低。說明苜蓿也可能通過滲透調(diào)節(jié)來限制水分散失。

本試驗通過對苜蓿葉片表面蠟質(zhì)覆蓋觀察和蠟質(zhì)含量的測定以及抗旱生理和抗旱性分析，結果表明，苜蓿品種葉片表面蠟質(zhì)覆蓋與抗旱性存在一定的正相關性，可為抵抗各種生物和非生物脅迫的角質(zhì)層蠟質(zhì)基因在苜蓿品種的抗性改良和選育提供新途徑和參考指標。

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