方迎艷，關(guān)宿東，郭曉磊，葉紅偉，汪華學(xué)，高 琴△

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院ICU，安徽 蚌埠233004）

內(nèi)毒素的主要成分脂多糖是細(xì)菌致病的主要物質(zhì)之一，進(jìn)入機(jī)體可引起內(nèi)毒素血癥或膿毒血癥，導(dǎo)致機(jī)體多器官損傷和功能障礙。呼吸功能障礙是內(nèi)毒素血癥最常見(jiàn)、致命的并發(fā)癥之一，內(nèi)毒素血癥休克病程中膈肌收縮功能?chē)?yán)重?fù)p傷，與結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）和誘導(dǎo)型 NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）顯著激活有關(guān)［1，2］。近年來(lái)研究觀察到，內(nèi)毒素引起的膈肌損傷與局部炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生過(guò)多、氧自由基明顯增加和蛋白質(zhì)水解途徑（鈣蛋白酶和半胱天冬酶 caspase）的激活密切相關(guān)［3］，caspase-3可引起肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白釋放，誘導(dǎo)膈肌無(wú)力［4］。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)毒素血癥大鼠膈肌iNOS活性和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA表達(dá)的變化，探討內(nèi)毒素血癥膈肌損傷的細(xì)胞凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、主要試劑

沙門(mén)氏菌屬精制內(nèi)毒素L-2880購(gòu)自Sigma公司；總RNA提取試劑（Trizol）購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；NOS（分型）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）和蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Bax、Bcl-2和caspase-3引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：βactin（630 bp），上游：5＇-GATGGTG GGTATGGGT CAGAAGGAC-3＇，下游：5＇-GCTCATTGCCGA TAGTGATGACT-3＇；Bax（494 bp），上游：5＇-GGATCGAGCAGAGAGGA TGG-3＇，下游：5＇-TGGTGAGTGA GGCAGTGAGG-3’；Bcl-2（227 bp）上游：5＇-CTGGTGGA CAACATCGCT CTG-3＇，下 游：5＇-GGTCTGCTGACCTCA CTTGTG-3＇；caspase-3（349 bp），上 游：5＇-AAGCC GAAACTCTTCA TC-3＇，下游：5＇-TCAGCA TTGACAC AATACAC-3＇。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

成年雄性SD大鼠32只，體重為200～250 g，清潔級(jí)，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成4組（n＝8）：生理鹽水對(duì)照組和內(nèi)毒素24 h組，48 h組，96 h組，即內(nèi)毒素腹腔注射12 mg／kg，分別于注射內(nèi)毒素后 24 h、48 h、96 h處死大鼠［5］，處死前稱(chēng)量各組大鼠體重。

1.3 膈肌標(biāo)本的采集

水合氯醛麻醉后斷頭處死大鼠，速取膈肌并稱(chēng)重，計(jì)算膈肌重／體重比。在冰生理鹽水漂洗后秤膈肌100 mg，液氮凍存后-80℃低溫冰箱保存行 RTPCR檢測(cè)備用，剩余部分-80℃低溫冰箱保存生化指標(biāo)檢測(cè)備用。

1.4 膈肌組織iNOS、cNOS和SDH檢測(cè)

取膈肌組織制成10%的組織勻漿，分別檢測(cè)i-NOS、cNOS和SDH活性，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 RT-PCR檢測(cè) Bcl-2、Bax和 caspase-3 mRNA的表達(dá)

取100 mg膈肌組織，采用Trizol一步法提取組織總RNA 3μg為模板，隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。一次 cDNA 1.5μl為模板 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 3 min后，以（1）95℃ 50 s變性；（2）βactin退火溫度59.5℃，50 s；Bcl-2退火溫度 61.7℃，50 s；Bax退火溫度 62.3℃，50 s；Caspase-3退火溫度55.6℃，50 s；（3）72℃ 60 s，反應(yīng) 30個(gè)循環(huán)。取 5μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色。GIS凝膠處理系統(tǒng)拍攝記錄，使用圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度掃描做半定量分析，以目的基因與內(nèi)參對(duì)照的積分吸光度比值（Bcl-2／β-actin；Bax／βactin；caspase-3／β-actin）表示 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各組采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，并用 Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和膈肌重／體重比

與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素血癥大鼠96 h組體重和膈肌重／體重比值明顯降低（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Body weight and diaphragm／body weight ratio of rats（±s，n＝8）

Tab.1 Body weight and diaphragm／body weight ratio of rats（±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group Body weight（g）Diaphragm weight／body weight（×10-3）Control 286.86±11.00 3.20±0.22 Endotoxin 24 h 285.63±12.66 3.22±0.22 Endotoxin 48 h 275.63±7.76 3.13±0.14 Endotoxin 96 h 253.13±7.99** 2.93±0.23*

2.2 膈肌組織NOS和SDH活性變化

與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌cNOS和iNOS活性明顯增強(qiáng)，48 h、96 h組較24 h組明顯升高（P＜0.01），24 h組較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；內(nèi)毒素血癥96 h和48 h組 SDH活性明顯降低，96 h組較24 h組降低明顯（P＜0.05），24 h組與正常對(duì)照組無(wú)明顯差別（表2）。

Tab.2 NOSand SDH activities of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

Tab.2 NOSand SDH activities of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

cNOS：Constitutive nitric oxide synthase；iNOS：Inducible nitric oxide synthase；SDH：Succinate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs endotoxin 24 h；△△P＜0.01 vs endotoxin 48 h

G r o u p c N O S（U／m g p r o）i N O S（U／m g p r o）S D H（U／m g p r o·m i n ）C o n t r o l 0.1 2±0.0 5 0.0 2±0.0 1 8.1 6±0.2 8 E n d o t o x i n 2 4 h 0.3 6±0.0 4** 0.2 1±0.0 5** 7.8 5±0.2 9 E n d o t o x i n 4 8 h 0.6 1±0.1 0**＃＃ 0.4 0±0.0 5**＃＃ 7.5 8±0.5 0*E n d o t o x i n 9 6 h 0.7 9±0.1 1**＃＃△△ 0.6 4±0.1 3**＃?！鳌?7.3 2±0.3 8**＃

2.3 膈肌組織Bcl-2、Bax和caspase-3的變化

與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌Bax mRNA的表達(dá)顯著升高，內(nèi)毒素48 h、96 h組較24 h組明顯升高，且96 h組較48 h組明顯升高；Bcl-2mRNA的表達(dá)及Bcl-2／Bax mRNA比值明顯降低，48 h、96 h組較24 h組有明顯降低，且96 h組較48 h組明顯降低（P＜0.01，圖 1A和圖 1B，表 3）；caspase-3 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，48 h、96 h組較24 h組明顯增強(qiáng)，且 96 h組較48 h組明顯增強(qiáng)（P＜0.01，圖 1，表 3）。

Fig.1 Changes of Bcl-2（A），Bax（B）and caspase-3（C）mRNA expressions of diaphragm tissue in rats

3 討論

內(nèi)源性一氧化氮主要是由NOS催化L-精氨酸生成。NOS主要包括三種：iNOS、內(nèi)皮型 NOS（endothelial NOS，eNOS）和神經(jīng)型 NOS（neuronal NOS，nNOS）。其中 eNOS與 nNOS合稱(chēng)為結(jié)構(gòu)型 NOS（cNOS）。正常生理情況下，iNOS基因不表達(dá)，只有在內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子的刺激下才能產(chǎn)生和表達(dá)，并在輔助因子和還原型輔酶Ⅱ的作用下生成大量一氧化氮（nitric oxide，NO）。脂多糖誘導(dǎo)的敗血癥休克大鼠模型，直接呈休克晚期癥狀，總NOS、iNOS和 cNOS表達(dá)增加［6］，內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌以cNOS為主要構(gòu)型，iNOS顯著激活，但NO途徑可能不參與內(nèi)毒素血癥膈肌肌漿網(wǎng)釋放Ca2＋障礙［1］，也不調(diào)控神經(jīng)肌肉接頭的信息傳遞，在膈肌收縮功能障礙中不發(fā)揮重要作用［2］。經(jīng) iNOS產(chǎn)生的NO發(fā)揮毒性作用，高濃度的NO在體內(nèi)形成ONOO-，破壞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，誘導(dǎo)線粒體膜通道開(kāi)放，釋放出細(xì)胞色素 C，引起 caspase的激活［7］，同時(shí)還可上調(diào)腫瘤抑制蛋白p53，后者可上調(diào)促凋亡蛋白Bax和下調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl-2［8］，Bcl-2／Bax的比值影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax可以導(dǎo)致凋亡促進(jìn)因子從線粒體中被釋放、下游caspase被活化和線粒體功能喪失，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡［9］。目前 caspase-3是公認(rèn)的凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶，是多條凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，與多種細(xì)胞發(fā)生凋亡變化有密切關(guān)系。Caspase-3既是一種最重要的執(zhí)行酶，同時(shí)也是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶。脂多糖干預(yù)的大鼠心臟Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)進(jìn)一步增加，Bcl-2／Bax比值下降，隨干預(yù)的時(shí)間延長(zhǎng)，器官受損程度逐漸加重，細(xì)胞凋亡增加［10］。大鼠腹腔注射內(nèi)毒素96 h后caspase-3活性顯著增強(qiáng)，激活經(jīng)caspase介導(dǎo)的膈肌無(wú)力［5］。SDH是所有需氧的細(xì)胞線粒體三羧酸循環(huán)（糖代謝途徑）酶系中的一種脫氫酶，即線粒體標(biāo)志酶和三羧酸循環(huán)的限速酶。

本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到：內(nèi)毒素血癥大鼠96 h組膈肌質(zhì)量和SDH活性明顯降低，說(shuō)明膈肌萎縮和線粒體損傷；膈肌組織iNOS活性明顯增強(qiáng)，并隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，激活明顯增強(qiáng)；Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)顯著增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)和 Bcl-2／Bax比值明顯降低，并隨著干預(yù)的時(shí)間延長(zhǎng)，變化明顯加劇，提示Bcl-2抑制凋亡的作用明顯降低，Bax促凋亡作用增強(qiáng)，激活caspase-3，導(dǎo)致膈肌細(xì)胞凋亡，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，促凋亡的作用加強(qiáng)，啟動(dòng)膈肌細(xì)胞凋亡，促成膈肌萎縮。

Tab.3 Expressions of Bcl-2，Bax and caspase-3mRNA of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

Tab.3 Expressions of Bcl-2，Bax and caspase-3mRNA of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs endotoxin 24 h；△△P＜0.01 vs endotoxin 48 h

Group Bcl-2／β-actin Bax／β-actin Bcl-2／Bax Caspase-3／β-actin Control 0.88±0.04 0.49±0.06 1.18±0.26 0.14±0.01 Endotoxin 24 h 0.78±0.02** 0.68±0.07** 1.17±0.15** 0.29±0.03**Endotoxin 48 h 0.58±0.05**＃＃ 0.84±0.12**＃＃ 0.71±0.10**＃＃ 0.42±0.03**＃＃Endotoxin 96 h 0.47±0.03**＃?！鳌?1.07±0.12**＃＃△△ 0.44±0.05**＃?！鳌?0.54±0.05**＃?！鳌?/p>

綜上所述，內(nèi)毒素血癥大鼠隨病程的延長(zhǎng)，膈肌組織iNOS活性顯著增強(qiáng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生NO的毒性作用損傷線粒體，上調(diào)促凋亡基因Bax和下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2，啟動(dòng)經(jīng)caspase-3的細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致膈肌損傷和萎縮。

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