羅心靜，莫選榮，周玲玲

（臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，浙江臺(tái)州318000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以周圍關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥及骨質(zhì)破壞為主要病理特征的系統(tǒng)性自身免疫病。熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）72是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的一種應(yīng)激蛋白，其基本功能起到“分子伴侶”作用。研究表明，Hsp72能主動(dòng)或被動(dòng)釋放到細(xì)胞外，并且與免疫細(xì)胞表面 TLR2／4受體（toll-like receptor 2／4）結(jié)合，參與對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)［1］。為了探討細(xì)胞外Hsp72在RA滑膜炎癥的作用及機(jī)制，本研究采用重組的Hsp72處理滑膜細(xì)胞，觀察Hsp72對(duì)促炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)的影響，并且用TLR2或TLR4蛋白的單克隆抗體封閉TLR2或TLR4受體，觀察TLR2或TLR4受體在Hsp72調(diào)控 IL-10表達(dá)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Hsp72重組蛋白購自加拿大Stressgen公司；IL-10 ELISA試劑盒購自美國 RD公司；多粘菌素 B（PMB）、卵清蛋白（OVA）購自美國 Sigma公司；TLR2、TLR4小鼠單克隆抗體購自美國eBioscience公司；GAPDH小鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；PCR酶購自日本Takara公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1.2 滑膜細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

滑膜組織標(biāo)本來自關(guān)節(jié)置換術(shù)中所取下的新鮮RA患者滑膜組織，滑膜細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)［2］。

1.3 IL-10水平檢測

滑膜細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測上清中IL-10的水平。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 RT-PCR分析

用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測量A260nm／A280nm比值。用鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒 （AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈；用1μl的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，引物如下：TLR2 sense：5＇-GCCAAAGTCTTGATTGATTGG-3＇，TLR2 antisense：5＇-TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG-3＇； TLR4 sense：5＇-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3＇，TLR4 antisense：5＇-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3＇；GAPDH sense：5＇-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3＇，GAPDH antisense：5＇-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3＇。

TLR2和TLR4按如下的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃變性30 s，61℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，擴(kuò)增 35個(gè)循環(huán)；GAPDH的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增22個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 Western blot分析

滑膜細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，加入2×SDS裂解液裂解細(xì)胞，然后離心并收集上清，用Bradford法測定總蛋白濃度。將上清與6×SDS加樣緩沖液（187.5 mmol／L Tris-HCl pH 6.8，6%SDS，30%甘油，150 mmol／LDTT，0.1%溴酚藍(lán)）混合，煮沸 10 min，經(jīng) 10%SDSPAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下封閉4 h后，分別加入TLR2、TLR4或GAPDH等單克隆一抗，4℃過夜。洗去游離一抗后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，反應(yīng)2 h。洗去游離二抗后，用DAB顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件包處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差（One-Way ANOVA）分析。

2 結(jié)果

2.1 滑膜細(xì)胞中TLR2或TLR4表達(dá)的檢測

RT-PCR結(jié)果（圖1A）表明，RA滑膜細(xì)胞中均存在TLR2和 TLR4mRNA的表達(dá)，TNF-α（5～20 ng／ml）刺激 6 h后 TLR2和TLR4mRNA表達(dá)明顯增加；Western blot（圖1B）結(jié)果也表明，RA滑膜細(xì)胞均存在 TLR2和 TLR4蛋白的表達(dá)，TNF-α（5～20 ng／ml）刺激12 h后TLR2和TLR4蛋白表達(dá)明顯增加。

2.2 TLR2或 TLR4受體封閉對(duì)Hsp72所誘導(dǎo)的IL-10分泌的影響

ELISA結(jié)果顯示，重組Hsp72刺激RA滑膜細(xì)胞24 h后能夠顯著誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分泌IL-10；煮沸預(yù)處理能消除Hsp72對(duì)IL-10分泌的促進(jìn)作用，而PMB預(yù)處理卻不能消除Hsp72對(duì)IL-10分泌的影響。此外，抗TLR4單克隆抗體預(yù)處理滑膜細(xì)胞30 min后，Hsp72所誘導(dǎo)IL-10的分泌顯著降低，而抗TLR2單克隆抗體或無關(guān)抗體（IgG）預(yù)處理滑膜細(xì)胞，對(duì)IL-10的分泌無明顯影響（表1）。

Fig.1 Expression of TLR2／4 in RA synoviocytes

Tab.1 Secretion of IL-10 in RA synoviocytes in each group detected by ELISA（pg／ml，±s，n＝6）

Tab.1 Secretion of IL-10 in RA synoviocytes in each group detected by ELISA（pg／ml，±s，n＝6）

Hsp72：Heat shock protein 72；PMB：Polymyxin B；TLR：Toll-like receptor；IL-10：Interleukin-10*P＜0.05 vs control； ＃P＜0.05 vs Hsp72 group

G r o u p I L-1 0 C o n t r o l 8 0.8±1 4.4 H s p 7 2 2 1 0.5±3 2.4*H s p 7 2＋b o i l i n g 2 0 8.5±3 1.3＃H s p 7 2＋P M B 8 3.6±1 5.9 T L R 2 a n t i b o d y＋H s p 7 2 2 0 3.8±3 4.4 T L R 4 a n t i b o d y＋H s p 7 2 1 0 5.2±1 6.5＃I g G＋H s p 7 2 2 0 8.0±3 5.6

3 討論

正常情況下，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子保持動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體免疫功能正常的必要條件。但是當(dāng)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生過高，或抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生相對(duì)過低，這種平衡就被打破，機(jī)體免疫功能就會(huì)出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致RA等自身免疫性疾病的發(fā)生。大量證據(jù)表明，在RA的滑膜及滑膜液中，存在多種促炎細(xì)胞因子的顯著增高，主要包括TNF-α、IL-6等，這些促炎細(xì)胞因子的顯著升高是RA發(fā)生發(fā)展的重要因素。而IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子。IL-10能抑制促炎細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-6、IL-12、IFN-γ的生成，用 IL-10處理關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型能明顯延緩滑膜炎癥的進(jìn)展［3］。因此，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生或促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生是治療RA的有效策略。

細(xì)胞外Hsp72的功能目前尚不十分清楚，但是已有的研究表明細(xì)胞外Hsp72參與機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。重組Hsp72能夠刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1等，具有促炎功能和細(xì)胞因子樣作用［4］。重組Hsp72也能誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子（如IL-10）生成，發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

雖然有學(xué)者研究證實(shí)RA患者關(guān)節(jié)滑膜液和血液中Hsp72表達(dá)水平明顯升高［2］，但細(xì)胞外Hsp72在RA炎癥中的作用目前尚不清楚。為了進(jìn)一步明確Hsp72的抗炎作用，本研究觀察了Hsp72對(duì)滑膜細(xì)胞抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)的影響。結(jié)果表明，Hsp72能直接誘導(dǎo)滑膜成細(xì)胞分泌IL-10。為了排除重組Hsp72中微量LPS污染可能對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響，本研究用PMB（能滅活LPS，對(duì)蛋白質(zhì)活性沒影響）或煮沸（能使蛋白失活，對(duì) LPS活性沒影響）兩種方法預(yù)處理Hsp72，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煮沸能消除Hsp72對(duì) IL-10分泌的影響，而PMB對(duì)Hsp72作用沒有影響。這些研究表明重組人Hsp72對(duì)RA滑膜細(xì)胞IL-10分泌的影響是Hsp72本身的特性而與LPS污染無關(guān)。

近年來研究表明，TLR2和TLR4參與固有免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外Hsp72的識(shí)別［5］。國外有學(xué)者利用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞膜表面上有TLR2和TLR4受體的高表達(dá)。本研究從mRNA和蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步證實(shí)TLR2和TLR4在RA滑膜細(xì)胞中的表達(dá)，并且滑膜細(xì)胞受炎癥因子刺激后TLR2和TLR4的表達(dá)水平升高，表明TLR2／4可能與RA炎癥調(diào)節(jié)有關(guān)。為了證明TLR2或TLR4是否參與Hsp72對(duì)滑膜細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，本研究使用抗TLR2或抗TLR4抗體分別封閉滑膜細(xì)胞表面的TLR2或TLR4受體。正如我們結(jié)果顯示，抗TLR4抗體預(yù)處理滑膜細(xì)胞，消除了Hsp72對(duì)IL-10生成的影響，而抗TLR2抗體預(yù)處理細(xì)胞對(duì)IL-10生成無明顯影響，這表明Hsp72對(duì)滑膜細(xì)胞IL-10分泌的影響是TLR4依賴性的，以上研究提示，細(xì)胞外Hsp72可能通過與TLR4結(jié)合調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞的功能。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ Asea A.Heat shock proteins and toll-like receptors［J］.HandbExpPharmacol，2008，（183）：111-127.

［2］ Nguyen T T，Gehrmann M，Zlacka D，etal.Heat shock protein 70 membrane expression on fibroblast-like synovial cells derived from synovial tissue of patients with rheumatoid and juvenile idiopathic arthritis［J］.ScandJRheumatol，2006，35（6）：447-453.

［3］ Isomaki P，Luukkainen R，Saario R，etal.Interleukin-10 functions as an antiinflammatory cytokine in rheumatoid synovium［J］.ArthritisRheum，1996，39（3）：386-395.

［4］ Quintana F J，Cohen IR.Heatshock proteins as endogenous adjuvants in sterile and septic inflammation［J］.JImmunol，2005，175（5）：2777-82.

［5］ Medzhitov R.Toll-like receptors and innate immunity［J］.NatRevImmunol，2001，1（2）：135-145.