陳 娟,彭聿平,崔世維,包,邱一華△
(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系,江蘇南通226001;2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,江蘇南通226001;3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,江蘇淮安223001)
長(zhǎng)期以來(lái)兒茶酚胺被認(rèn)為是由神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞合成和釋放的一類(lèi)調(diào)節(jié)物。然而,近十多年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),淋巴細(xì)胞也能合成和分泌兒茶酚胺[1,2]。本實(shí)驗(yàn)室先前已報(bào)道,T淋巴細(xì)胞表達(dá)兒茶酚胺合成的限速酶--酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH),而且可合成和釋放兒茶酚胺,包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺,它們對(duì)T細(xì)胞的增殖、分化和凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[3-6]。已知類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制主要與CD4+T細(xì)胞中各類(lèi)亞群的功能失衡有關(guān)。如前所述,在正常情況下T細(xì)胞來(lái)源的兒茶酚胺可調(diào)節(jié)免疫功能,那么在RA慢性自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展中,T細(xì)胞是否發(fā)生兒茶酚胺合成的改變,目前尚不十分清楚。據(jù)此,本研究利用RA的小鼠模型--膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA),觀(guān)察CIA疾病過(guò)程中CD4+T細(xì)胞表達(dá)TH的變化,從而為T(mén)細(xì)胞來(lái)源的兒茶酚胺參與RA的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
DBA/1小鼠雄性,6~8周齡,體重為(18±2)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,SPF級(jí),室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。將體重相近的DBA/1小鼠隨機(jī)分為未處理空白組、佐劑組、35 d模型組和55 d模型組。
雞Ⅱ型膠原(collagenⅡ,CⅡ)購(gòu)自 Sigma公司;佛氏完全佐劑(complete freund′s adjuvant,CFA)購(gòu)自Chondrex公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購(gòu)自Sigma公司;小鼠抗TH單克隆抗體購(gòu)自Millipore公司;大鼠抗小鼠 CD4抗體購(gòu)自 AbD Serotec公司;FITC羊抗小鼠抗體購(gòu)自Sigma公司;羅丹明標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Leica倒置研究型顯微鏡、CM 1900型冰凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó) Leica公司。
取CⅡ溶于0.1 mol/L的冰醋酸溶液中使終質(zhì)量濃度為2mg/ml,置4℃儲(chǔ)存過(guò)夜。取上述 CⅡ溶液與CFA等體積混合,于冰上充分乳化制成膠原乳劑。免疫動(dòng)物時(shí),在小鼠尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 ml膠原乳劑,基礎(chǔ)免疫后第21天在腹腔注射該膠原乳劑0.1ml進(jìn)行加強(qiáng)免疫,為了加速關(guān)節(jié)炎發(fā)生分別于第28天、第32天腹腔注射LPS 20μg。佐劑組是用CFA與0.1 mol/L的冰醋酸溶液等體積充分乳化后于實(shí)驗(yàn)第1天在每只小鼠的尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1ml乳劑,第21天在腹腔注射該乳劑0.1ml。
小鼠在初次免疫后每天觀(guān)察前后足的病變情況;并在初次免疫后第22天開(kāi)始,每3 d進(jìn)行關(guān)節(jié)炎癥的臨床評(píng)分,各關(guān)節(jié)病變程度按4級(jí)評(píng)分法[7]?!?”:所有的關(guān)節(jié)無(wú)任何腫脹或變紅;“1”:輕度的紅和(或)腫;“2”:明顯的紅腫;“3”:關(guān)節(jié)僵硬或畸形強(qiáng)直。每只小鼠所有關(guān)節(jié)均被評(píng)分,最高分為12分。
小鼠在初次免疫后第35天和55天分別處死,取踝關(guān)節(jié),剝離皮膚后,去除多余的皮下組織,關(guān)節(jié)用4%多聚甲醛固定,10%EDTA脫鈣,切片,HE染色,光鏡下觀(guān)察組織病理變化。
小鼠在初次免疫后第35天或55天,用復(fù)合麻醉劑2ml進(jìn)行腹腔麻醉后,灌注、固定、取腸系膜淋巴結(jié)和脾臟,冰凍切片,片厚20μm,PBS漂洗,加山羊血清封閉30 min,PBS漂洗,加一抗即小鼠抗TH單克隆抗體(1∶150稀釋?zhuān)┖痛笫罂剐∈驝D4抗體(1∶300稀釋?zhuān)?,室溫孵?18~24 h,PBS漂洗,加二抗即FITC羊抗小鼠抗體(1∶100稀釋?zhuān)┖土_丹明標(biāo)記山羊抗大鼠 IgG(1∶150稀釋?zhuān)?,室溫孵? h,PBS漂洗3次,上述抗體均用0.01 mol/L PBS稀釋。將上述處理過(guò)的組織切片裱于經(jīng)明膠處理過(guò)的載玻片上,用封片劑封片。在同一視野熒光顯微鏡下觀(guān)察,淋巴結(jié)和脾臟各切片隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行照相,然后統(tǒng)計(jì)每張切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差(one-way ANOVA)分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和比較。
小鼠的關(guān)節(jié)紅腫多發(fā)生于初次免疫后的第29~32天,首先是前足紅腫,以后延伸至后足,亦可同時(shí)出現(xiàn),病變可累及足墊、趾間關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié),并逐漸加重,于初次免疫后第46天左右紅腫達(dá)到高峰;初次免疫后35 d和初次免疫后55 d小鼠關(guān)節(jié)紅腫無(wú)明顯差異(圖1)。而正常組和佐劑組無(wú)關(guān)節(jié)紅腫表現(xiàn)(圖1)。另外,在發(fā)病過(guò)程中,模型小鼠出現(xiàn)飲食及運(yùn)動(dòng)減少、舔足、毛色失去光澤、尾根部注射處有潰爛等現(xiàn)象。
小鼠自初次免疫后第22天開(kāi)始,每3 d進(jìn)行關(guān)節(jié)炎癥的臨床評(píng)分??梢?jiàn)DBA/1小鼠注射膠原乳劑后足爪分值從第29天開(kāi)始升高,第46天達(dá)高峰,臨床評(píng)分達(dá)8.8分,與足爪腫脹外觀(guān)一致;而正常組和佐劑組均為0分(圖2)。
Fig.1 Photographs of swelling paws of DBA/1mice with CIA CIA:Collagen-induced arthritis
Fig.2 Change in clinical scores of arthritis in process of CIA(n=5)
小鼠在初次免疫后第35天和55天分別處死,取踝關(guān)節(jié),標(biāo)本經(jīng)固定、脫鈣、切片并進(jìn)行HE染色。觀(guān)察病理切片發(fā)現(xiàn)CIA小鼠在發(fā)病早期(初次免疫后第35天)和發(fā)病晚期(初次免疫后第55天)其關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生、關(guān)節(jié)間隙變窄、部分關(guān)節(jié)軟骨破壞;而正常組和佐劑組可見(jiàn)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)清楚,未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生和軟骨破壞等異常改變(圖3)。
與正常組和佐劑對(duì)照組相比,CIA小鼠在發(fā)病早期和發(fā)病晚期均出現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)中TH+細(xì)胞數(shù)目明顯增多,而且CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目也顯著增加(圖4,表1)。我們將 TH+細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行共定位,發(fā)現(xiàn)在正常淋巴結(jié)中,有TH+和CD4+細(xì)胞的共定位,證明CD4+T細(xì)胞表達(dá)TH。在CIA小鼠的發(fā)病早期和發(fā)病晚期,淋巴結(jié)中具有TH+和CD4+共定位的細(xì)胞數(shù)均顯著多于正常組和佐劑對(duì)照組(圖4,表1),說(shuō)明在 CIA發(fā)病過(guò)程中,CD4+T細(xì)胞表達(dá)TH增加。在CIA小鼠的發(fā)病早期與發(fā)病晚期之間,TH+細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及它們共定位的細(xì)胞數(shù)目均沒(méi)有顯著性差異(圖4,表1)。
Fig.3 Histopathological changes in ankle jointof CIA(HE staining)
Fig.4 The expression of TH and CD4 in the mesenteric lymph nodes detected by double immunofluorescence staining(×200,insert×400)
與正常組和佐劑對(duì)照組相比,CIA小鼠在發(fā)病早期和發(fā)病晚期均出現(xiàn)脾臟中TH+細(xì)胞數(shù)目明顯增多,并且CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目也顯著增加(圖5,表2)。我們將TH+細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行共定位,發(fā)現(xiàn)在正常脾臟中,有TH+和CD4+細(xì)胞的共定位,證明CD4+T細(xì)胞表達(dá)TH。在CIA小鼠的發(fā)病早期和發(fā)病晚期,脾臟中具有TH+和CD4+共定位的細(xì)胞數(shù)均顯著多于正常組和佐劑對(duì)照組(圖5,表2),說(shuō)明在CIA發(fā)病過(guò)程中,CD4+T細(xì)胞表達(dá)TH增加。在CIA小鼠的發(fā)病早期與發(fā)病晚期之間,TH+細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及它們共定位的細(xì)胞數(shù)目均沒(méi)有顯著性差異(圖5,表2)。
Tab.1 Changes in number of TH/CD4 double-positive cells in themesenteric lymph nodes of CIAmice(±s,n=4)
Tab.1 Changes in number of TH/CD4 double-positive cells in themesenteric lymph nodes of CIAmice(±s,n=4)
TH:Tyrosine hydroxylase;CIA:Collagen-induced arthritis*P<0.05,**P<0.01 vs intact;#P<0.05,##P<0.01 vs vehicle
Group Number of TH+cells double-positive cells Intact 27.00±10.80 19.75±9.95 14.00±4.83 Vehicle 30.00±13.74 22.75±13.57 16.25±5.97 Day 35 after immunization 127.50±60.89**## 89.00±51.06**## 51.00±21.65**##Day 55 after immunization 104.00±27.51**# 78.25±19.92*# 52.75±15.90**##Number of CD4+cells Number of TH/CD4
Tab.2 Changes in number of TH/CD4 double-positive cells in the spleen of CIAmice(±s,n=4)
Tab.2 Changes in number of TH/CD4 double-positive cells in the spleen of CIAmice(±s,n=4)
TH:Tyrosine hydroxylase;CIA:Collagen-induced arthritis*P<0.05,**P<0.01 vs intact;#P<0.05 vs vehicle
Group Number of TH+cells double-positive cells Intact 14.25±3.40 9.75±4.03 6.00±2.58 Vehicle 14.50±4.12 11.75±2.50 5.25±1.71 Day 35 after immunization 28.75±11.79*# 21.75±5.74**# 13.25±6.75*#Day 55 after immunization 25.75±5.56*# 20.50±6.61*# 13.50±4.80*#Number of CD4+cells Number of TH/CD4
Fig.5 Expression of TH and CD4 in the spleen detected by double immunofluorescence assay(×200,insert×400)
神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)主要通過(guò)合成和釋放遞質(zhì)、激素、細(xì)胞因子等發(fā)生相互作用從而調(diào)節(jié)生物體的生理功能。兒茶酚胺包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺,它們主要由神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞合成和釋放。但近十多年來(lái)的研究說(shuō)明,免疫細(xì)胞也能產(chǎn)生兒茶酚胺,并對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[1-2]。免疫細(xì)胞具有與神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞類(lèi)似地合成和降解兒茶酚胺的酶系統(tǒng)。例如,用TH抑制劑α-甲基酪氨酸預(yù)孵育T或B淋巴細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)兒茶酚胺的含量明顯下降,提示淋巴細(xì)胞內(nèi)兒茶酚胺的合成依賴(lài)于TH[8]。我們先前已報(bào)道,淋巴細(xì)胞能表達(dá)兒茶酚胺合成的限速酶—TH;同時(shí)直接檢測(cè)到培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞內(nèi)和上清液中有去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺,表明淋巴細(xì)胞可合成和分泌兒茶酚胺;淋巴細(xì)胞合成和分泌的兒茶酚胺對(duì)T細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[3-6]。然而,淋巴細(xì)胞來(lái)源的兒茶酚胺是否參與免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。
RA是一個(gè)累及周?chē)P(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫病,臨床表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降,病變呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作的過(guò)程,其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。1980年Courtenay等建立了小鼠CIA模型,極大的推進(jìn)了RA發(fā)病機(jī)制和治療的研究。小鼠CIA作為類(lèi)似于RA的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎,關(guān)節(jié)局部紅腫,嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形。病理變化為增生性滑膜炎,關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),體內(nèi)可檢出針對(duì)Ⅱ型膠原的高滴度的IgG抗體,這些臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與人類(lèi)RA密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中我們以雞的CⅡ免疫6~8周雄性DBA/1小鼠,免疫后模型組多于第29~32天開(kāi)始出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫等關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn),關(guān)節(jié)炎評(píng)分逐漸升高,第46天達(dá)到高峰,觀(guān)察病理切片發(fā)現(xiàn)CIA小鼠在發(fā)病早期和發(fā)病晚期其關(guān)節(jié)滑膜組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜組織增生,關(guān)節(jié)間隙變窄,部分關(guān)節(jié)軟骨破壞。這些病理改變及體征與文獻(xiàn)報(bào)道一致,提示CIA模型制備成功。
Miller等[9]報(bào)道,RA病人的關(guān)節(jié)滑膜組織中巨噬細(xì)胞釋放去甲腎上腺素,而且隨著關(guān)節(jié)炎癥的加重,巨噬細(xì)胞釋放去甲腎上腺素增加。這一研究提示作為固有免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞可合成和釋放兒茶酚胺,這些兒茶酚胺與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。CD4+T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫細(xì)胞--T細(xì)胞的一種亞群。我們研究發(fā)現(xiàn),在正常小鼠的淋巴結(jié)和脾臟中,也存在TH+和CD4+共定位的細(xì)胞,但在CIA小鼠的發(fā)病早期和發(fā)病晚期,其腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中的TH+細(xì)胞數(shù)目和CD4+T細(xì)胞數(shù)目顯著增多,而且TH+和CD4+共定位的細(xì)胞數(shù)目也明顯增多。這些結(jié)果不但說(shuō)明在正常淋巴組織中CD4+T細(xì)胞能合成兒茶酚胺,而且提示T細(xì)胞合成的兒茶酚胺也參與了RA的疾病過(guò)程,因而為適應(yīng)性免疫細(xì)胞來(lái)源的兒茶酚胺涉及 RA的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸提供了證據(jù)。最近,Capellino等[10]報(bào)道在 RA疾病的初期,關(guān)節(jié)炎局部的細(xì)胞產(chǎn)生兒茶酚胺增加,這些兒茶酚胺具有很強(qiáng)的抗炎作用。因此,我們推測(cè)在RA疾病過(guò)程中T細(xì)胞合成兒茶酚胺增加是一種局部的抗炎機(jī)制。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Cosentino M,F(xiàn)ietta A M,F(xiàn)errari M,etal.Human CD4+CD25+regulatory T cells selectively express tyrosine hydroxylase and contain endogenous catecholamines subserving an autocrine/paracrine inhibitory functional loop[J].Blood,2007,109(2):632-642.
[2] Engler K L,Rudd M L,Ryan JJ,etal.Autocrine actions ofmacrophage-derived catecholamines on interleukin-1β[J].JNeuroimmunol,2005,160(1-2):87-91.
[3] Jiang JL,Peng Y P,Qiu Y H,etal.Adrenoreceptor-coupled signal-transduction mechanisms mediating lymphocyte apoptosis induced by endogenous catecholamines[J].JNeuroimmunol,2009,213(1-2):100-111.
[4] Jiang JL,Peng Y P,Qiu Y H,etal.Effect of endogenous catecholamines on apoptosis of Con A-activated lymphocytes of rats[J].JNeuroimmunol,2007,192(1-2):79-88.
[5] Qiu YH,Cheng C,Dai L,etal.Effectofendogenous catecholamines in lymphocytes on lymphocyte function[J].J Neuroimmunol,2005,167(1-2):45-52.
[6] Qiu YH,Peng Y P,Jiang JM,etal.Expression of tyrosine hydroxylase in lymphocytes and effect of endogenous catecholamines on lymphocyte function [J].Neuroimmunomodulation,2004,11(2):75-83.
[7] Williams RO,F(xiàn)eldmann M,MainiRN.Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(20):9784-9788.
[8] Cosentino M,BombelliR,F(xiàn)errariM,etal.HPLC-EDmeasurement of endogenous catecholamines in human immune cells and hematopoietic cells lines[J].LifeSci,2000,68(3):283-295.
[9] Miller L E,Justen H P,Scholmerich J,etal.The loss of sympathetic nerve fibers in the synovial tissue of patientswith rheumatoid arthritis is accompanied by increased norepinephrine release from synovial macrophages[J].FASEB J,2000,14(13):2097-2107.
[10] Capellino S,Cosentino M,Wolff C,etal.Catecholamineproducing cells in the synovial tissue during arthritis:modulation of sympathetic neurotransmitters as new therapeutic target[J].AnnRheumDis,2010,69(10):1853-1860.