王霄龍 ，楊永霞，張松濤，馮琦，王晶，武東玲，崔紅

河南農業(yè)大學煙草學院 ，煙草行業(yè)栽培重點實驗室，鄭州市文化路 95 號 450002

煙草葉面腺毛豐富且具有較強的分泌能力[1]，腺毛分泌物不僅對煙株抗性具有積極作用，與煙葉香氣品質和風味形成也密切相關[2]。因而，關于煙草腺毛生長發(fā)育、分泌及其與煙葉品質關系的研究頗受關注。Severson等[3]報道，氮供給、水分脅迫、機械傷害、光強和光質以及栽培措施都會對葉面分泌物的含量和組分產生影響。Heemann等[4]曾報道，分別種植在美國北卡羅來納州Oxford和Tifton兩地區(qū)的煙草品種NC2326，其腺毛分泌物中西柏三烯二醇含量相差3～4倍，而非腺毛產生的烴類含量差異很小。高致明等報道我國云南香料煙腺毛密度遠遠大于新疆香料煙，煙葉的質量風格也有很大不同[5]。由此推測，在特定生態(tài)區(qū),由于環(huán)境因子的綜合作用，葉面腺毛發(fā)育及物質分泌具有其特定特點，進而影響煙葉質量及風格。

我國地域遼闊，生態(tài)環(huán)境復雜，形成了以濃香型、清香型和中間香型為代表的不同烤煙類型[6]。貴州遵義為中間香型烤煙的典型產區(qū)，所產烤煙煙氣細膩較柔和、較濕潤，雜氣輕、刺激輕微，余味干凈較舒適，是中式卷煙的重要原料[7-8]。關于中間香型煙葉香氣風格的形成機理研究多集中在葉片發(fā)育規(guī)律、物質代謝規(guī)律等方面，而腺毛作為葉面化學物質的主要來源部位，研究相對較少。本文以貴州遵義煙區(qū)烤煙品種K326為材料，采用顯微觀察、GC/MS技術及RT-PCR技術，對葉片發(fā)育過程中葉面腺毛形態(tài)結構、分泌物含量及分泌物合成相關基因表達進行了系統(tǒng)研究，旨在探索貴州煙葉葉片腺毛發(fā)育和物質分泌的特點，為中間香型烤煙風格形成機理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙品種K326種植在貴州省遵義縣鴨溪鎮(zhèn)試驗基地。2011年5月5日移栽，試驗地土壤肥力中等，行距100 cm，株距50 cm，按當?shù)乜緹熒a標準進行正常栽培管理。于煙株返苗后，挑選生長發(fā)育較為均勻一致的煙株300棵，分別掛牌標記，并按照葉齡順序取樣（第十片葉長度達到5 cm時定為第1天）。

1.2 方法

1.2.1 腺毛形態(tài)觀察

從葉尖向葉基數(shù)第6至8條支脈間，主脈至右側葉緣之間的中央位置[9]，每樣取5份作為重復取樣，4 % 戊二醛（磷酸緩沖液pH=7.2）固定 ，經脫水、置換、干燥、粘樣、噴鍍等過程后，使用Ouanta 200掃描電鏡（美國FEI公司制造）觀察并拍照記錄，采用氣體二次電子成像；工作電壓15～20 kV，工作距離14.5～20 mm。腺毛密度統(tǒng)計時選取5個視野作為重復，并進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 葉面化學分析

葉面分泌物采用圓片法[10]。分別在葉基部和葉中部于主脈兩側對稱位置及葉尖沿主脈位置切取直徑為10 cm的圓片共15片，將圓片在1000 mL萃取溶劑中依次浸提2 s，重復3次后加入含正十七烷醇和蔗糖八乙酸酯的內標1 mL，得到的浸提液分別經過過濾、旋轉蒸發(fā)儀濃縮、氮吹儀吹干、硅烷化處理后采用氣質聯(lián)用分析儀并通過檢索譜庫（NIST08）確定成分。

GC條件：色譜柱為DB-5MSUI石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度為250 ℃；程序升溫：40 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min升溫至180 ℃保持2 min，以2 ℃/min升溫至280 ℃保持20 min；載氣為高純氦氣，載氣流速為恒流0.8 mL/min；進樣量為1.0 μL，分流比為15:1。

MS條件：傳輸線溫度為250℃；EI離子源溫度為280℃；電離能量為70 eV；質量數(shù)范圍在50～650 amu之間。

通過保留時間定性物質，后積分各物質對應峰曲線與基線的面積，得出具體數(shù)值，各種物質數(shù)據(jù)經過單位換算之后與參試葉片面積之比，即為單位面積葉片表面分泌物之值。

葉面積采用肖強等[11]的方法用數(shù)碼相機采集圖像后分析得出結果。由于葉齡10 d及20 d的葉片面積較小，故采用總面積相近的整葉替代圓片（面積差異小于5 %）。

1.2.3 RT-PCR分析

選取生長發(fā)育良好的中部葉，按葉齡取樣，液氮凍保。每次取樣將來源于不同煙株的三片葉混合以減少試驗誤差。按照Invitrogen Trizol Reagent說明書提供方法提取煙草總RNA，樣品通過隨機引物法反轉錄合成cDNA。采用Premier Prime 5.0軟件，根據(jù)Genbank發(fā)布的CYC-1、CYP71D16和L25序列設計各基因擴增引物(表1)，進行RT-PCR。其中L25是煙草核糖體蛋白[12]，本研究中作為內參基因。

表1 擴增引物序列

PCR反應體系為20 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s變性，50℃ 30 s退火，72 ℃1 min延伸，共33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 腺毛形態(tài)結構及發(fā)育過程觀察

利用顯微技術對葉片發(fā)育過程中葉面腺毛進行觀察，發(fā)現(xiàn)腺毛密度、形態(tài)結構隨著葉片發(fā)育過程呈現(xiàn)規(guī)律性變化。圖1顯示葉齡10 d時腺毛密度達到最高，隨后急劇下降。這可能是由于葉片進入快速生長期，葉面積迅速擴展而引起；從20 d到40 d腺毛密度呈平緩下降的趨勢，而在葉齡50 d時又有明顯的下降。

圖1 不同時期腺毛密度變化趨勢

對葉齡10 d和50 d的葉片進行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)K326葉面腺毛主要由長柄多腺頭腺毛組成。在葉齡10 d時，腺毛密度濃密，腺頭細胞主要由1～2個細胞組成；而且大量新生腺毛不斷發(fā)生（圖2-A1,A3）。說明該時期是腺毛分化、形成的重要時期。在葉齡50 d 時，腺毛密度明顯降低，而且不再有新生腺毛的發(fā)生；腺頭由多個細胞組成，并開始皺縮、脫落，推測腺毛進入成熟、衰老階段（圖2-A2,A4）。

圖2 腺毛形態(tài)結構及發(fā)育過程觀察

2.2 葉面化學分析

采用葉圓片法提取葉面分泌物，利用GC/MS共檢測出物質成分47種，包括未知成分12種；已知成分35種。其中，西柏烷類化合物是腺毛特異分泌的主要成分，另外也檢測到烷烴，蔗糖酯等物質，見圖3。

圖3 不同葉齡色譜分析圖

圖4 腺毛分泌物西柏三烯二醇和西柏三烯一醇含量

圖4顯示葉片發(fā)育過程中西柏烷類化合物含量的變化趨勢?？梢钥闯觯何靼厝┒己枯^高，西柏三烯一醇含量較低。二者都呈現(xiàn)出先上升，后下降，再上升的趨勢。而且，在葉齡20 d時都出現(xiàn)一個峰值，隨后逐漸降低，40 d后開始緩慢上升，并在70 d時達到最大值。

2.3 西柏烷化合物合成關鍵基因的表達分析

由于西柏烷類化合物只在腺毛中合成[13]，故以葉片總RNA為模板進行RT-PCR分析，亦能反映出腺毛中該基因的表達規(guī)律。

西柏三烯一醇合成酶（cembratriene-ol synthase，CYC-1）是將牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸轉化為西柏三烯一醇的關鍵酶[14]；西柏三烯一醇羥化酶（cembratriene-ol hydroxylase，CYP71D16），則催化西柏三烯一醇向西柏三烯二醇轉化[15]。二者都是西柏烷類化合物合成的關鍵酶，與腺毛的物質代謝和分泌密切相關。以L25基因為內參，對葉片發(fā)育過程中這兩個基因進行表達分析，結果如圖5所示?？梢钥闯觯瑑苫虻谋磉_趨勢有一定協(xié)同性，都在葉齡20 d、40 d和70 d時表達較強，這與腺毛分泌物中西柏烷類化合物的含量變化趨勢一致，說明CYC-1和CYP71D16是調控西柏烷類化合物合成的關鍵基因，其表達強度強烈影響西柏烷類化合物的含量。

圖5 不同葉齡腺毛類萜代謝關鍵基因半定量表達分析

3 討論

從腺毛形態(tài)學來看，貴州遵義地區(qū)烤煙品種K326葉面腺毛以長柄腺毛為主，這與河南種植的K326相同(見后續(xù)報道)，表明生態(tài)環(huán)境對腺毛的類型影響不大。腺毛密度在20 d前變化明顯，之后緩慢減少，這可能是由于煙株進入成熟階段，腺毛不再發(fā)生，成熟腺毛開始脫落而造成，這與時向東等[9]的報道一致?；瘜W分析結果表明，遵義地區(qū) K326葉面化學成分中西柏烷類化合物占據(jù)絕對優(yōu)勢，這與史宏志等[16]的研究結果一致，表明不同生態(tài)環(huán)境中葉面分泌物保持一定的穩(wěn)定性。但檢測結果中發(fā)現(xiàn)了許多未知物質，不排除中間香型煙葉葉面分泌物中具有其獨特成分，而這需要不同香型煙葉葉面化學的比較研究結果支持。

在葉片發(fā)育過程中，西柏三烯一醇和西柏三烯二醇含量變化及其基因表達規(guī)律呈現(xiàn)高度一致，并在葉齡20 d時出現(xiàn)一個積累高峰。這可能是由于20 d后腺毛密度的急劇下降所造成。隨著葉片形態(tài)發(fā)育的完成，腺毛密度逐漸穩(wěn)定，葉面分泌物逐漸積累并在成熟采收前達到最高值，這與楊鐵釗等[17]的研究結果基本相同。從CYC-1和CYP71D16的表達規(guī)律來看，二者之間有緊密的協(xié)同性，變化趨勢與腺毛分泌物中西柏烷類化合物的含量變化趨勢一致。這說明其表達水平與代謝物質含量密切相關。

即使是在只有1～2個腺頭細胞的不成熟腺毛中，西柏烷類化合物的合成和分泌也在活躍進行，葉面化學成分檢測和基因表達強度均在20 d、40 d和70 d出現(xiàn)顯著增強，推測認為CYC-1和CYP71D16的表達水平與代謝物質含量密切相關。

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