夭建華, 胡明陽, 米其利, 黃海濤, 唐萍，李雪梅,繆明明

1云南煙草科學研究院，昆明市高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科醫(yī)路41號 650106；

2昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明市呈貢新區(qū)景明南路727號 650500

通常在毒理學試驗中，染毒方式對試驗結果有重要的影響。在采用細菌回復突變試驗（Ames試驗）、體外細胞微核試驗和中性紅細胞毒性試驗[1-4]進行煙用添加劑安全性評價和卷煙煙氣毒理學評價中，目前國內外煙草公司及相關的標準[5-7]均是采用吸煙機抽吸卷煙、劍橋濾片捕集煙氣總粒相物，再用二甲基亞砜（DMSO）將劍橋濾片上的煙氣總粒相物萃取出來后，與細菌或細胞一起培養(yǎng)，來檢測主流煙氣總粒相物的遺傳毒性或細胞毒性。這種經(jīng)典方法的優(yōu)點是煙氣樣品可以保存大約幾個月的時間，缺點是不能真正地反映新鮮煙氣的物理和化學特征，因為在這種測試中對煙氣氣相組分的關注很少，粒相物、氣相物和揮發(fā)性物質間的相互作用也沒有被考慮，另外，煙氣長時間放置后，化學成分發(fā)生變化會導致檢測結果的不穩(wěn)定。因此，全煙氣直接暴露法就應運而生。

卷煙全煙氣直接暴露方法是一種借鑒氣體染毒特點而建立的應用于卷煙煙氣細菌和細胞染毒的新方法。1999年，德國Fraunhofer毒理學和實驗醫(yī)學研究所的Aufderheide等首次報道了將細胞培養(yǎng)在氣液界面進行氣體暴露的Cultex細胞培養(yǎng)裝置和技術[8]，該技術被用于氣體的細胞毒性研究。后來為適應卷煙煙氣的毒性研究，開發(fā)了和吸煙機連接的整套系統(tǒng)，即卷煙全煙氣暴露系統(tǒng)裝置。

在卷煙全煙氣直接暴露法中，將卷煙經(jīng)吸煙機抽吸產(chǎn)生的全部煙氣即時與空氣稀釋后，直接通入到培養(yǎng)有鼠傷寒沙門氏菌或測試細胞的暴露容器中，煙氣與位于氣液界面（air/liquid interface）的細菌或細胞直接接觸來達到全煙氣暴露的目的，暴露后的細菌或細胞可繼續(xù)進行毒理學效應的測試，例如進行細胞毒性試驗、微核試驗和Ames試驗等。全煙氣暴露濃度用稀釋后的煙氣中TPM濃度作為指標進行控制。這種暴露方式使卷煙煙氣處于相對“原始”（native）的狀態(tài)，能相對模擬人吸煙時人體細胞接觸煙氣的情況，因而更能及時反映出細菌或細胞暴露于全煙氣成分中的真實情況。因此，全煙氣暴露方法作為一種新方法和新技術，正引起國內外煙草科研人員的關注。近幾年，在CORESTA和TSRC會議上關于該研究的交流論文較多[9-15]。目前，CORESTA體外毒理學小組也在積極進行全煙氣直接暴露方法的研究，并組織了相關的共同試驗和學術交流[16]。

卷煙全煙氣直接暴露研究的核心是暴露裝置和條件。由于卷煙全煙氣直接暴露方法是將培養(yǎng)的細胞暴露到煙氣中，因此，在體外暴露系統(tǒng)設計中必須實現(xiàn)以下要點[17]：（1）受試氣體產(chǎn)生的精確控制；（2）受試氣體的暴露時間和物理化學特性的精確控制；（3）細胞或細菌和受試氣體盡可能緊密接觸；（4）系統(tǒng)設計應該利于其暴露時間的擴展，一般細胞暴露于環(huán)境空氣中，會由于干燥而導致鈍化，因此暴露裝置應該有溫度和濕度維持系統(tǒng)來保證細胞或細菌的正常生長；（5）暴露后可以測定有代表性的終點，就像在動物試驗和臨床試驗一樣，必須有可以分析毒理學效應的標志物。

目前報道的卷煙全煙氣直接暴露方法中，測試細胞或細菌與煙氣的接觸方式主要有兩種類型，一種是氣液界面接觸式，即測試細胞或細菌處于相對固定狀態(tài)（測試細胞處于貼壁狀態(tài)，測試細菌被涂布在固體培養(yǎng)基上），一種是氣液接觸式，即測試細胞處于懸浮狀態(tài)，煙氣通入細胞懸浮液中達到煙氣暴露的目的。商品化裝置日本的Cultex[18]和德國的Vitrocell[19]，這兩種設備基本相同，暴露方式均是氣液界面接觸式。IT公司（Imperial Tobacco UK）設計的卷煙全煙氣細胞暴露裝置是基于氣液接觸式暴露方式[16]。

1 氣液界面接觸式煙氣暴露方式

基于貼壁細胞的氣液界面接觸式煙氣暴露方式是將卷煙煙氣直接通入培養(yǎng)于半透膜上的測試細胞，使測試細胞與煙氣處于氣液界面上而達到煙氣暴露的目的。目前，采用此種暴露方式的暴露裝置有兩類，一類是商品化的暴露裝置，如日本的Cultex[18]和德國的Vitrocell[19]，一類是煙草研究機構自行設計的暴露裝置，如BAT煙草公司的暴露裝置[20]，以及美國Battelle公司[16]和鄭州煙草研究院的暴露裝置[21]。

1.1 Cultex和Vitrocell的氣液界面接觸式煙氣暴露方式

1.1.1 暴露原理

由于Vitrocell[19]和Cultex全煙氣暴露系統(tǒng)裝置的工作原理和基本構造相同，Cultex的開發(fā)早于Vitrocell，且Cultex的報道較為系統(tǒng)，因此以Cultex為例介紹此類煙氣暴露方法。Cultex的暴露原理是將測試細胞或細菌固定在基質上，再進行煙氣暴露，即將細胞種植transwell小室（porous transwellTM）的底部有孔膜上，將細菌涂布在固體培養(yǎng)基上。暴露裝置由吸煙機、煙氣稀釋分配系統(tǒng)、培養(yǎng)基供應系統(tǒng)、培養(yǎng)基溫度維持系統(tǒng)以及細胞/細菌暴露裝置共五個部分組成[18-19]。圖1所示的是Vitrocell全煙氣暴露裝置的工作示意圖。用于貼壁細胞的煙氣暴露時，將細胞種植于一種特殊的可轉移的transwell小室（porous transwellTM）的底部膜上，小室底部接觸培養(yǎng)液，煙氣從煙氣稀釋分配系統(tǒng)進入暴露腔，和transwell小室上的細胞接觸后，由廢氣出口流出，完成煙氣的細胞暴露反應。暴露一定時間后，取出transwell小室，繼續(xù)進行細胞毒性指標試驗[20]。因此，細胞是位于氣-液界面上進行煙氣暴露，煙氣直接接觸細胞，從而實現(xiàn)全煙氣的暴露。

圖1 商品化全煙氣細胞暴露裝置工作示意圖（摘自文獻[18-19]，略作修改）

用于Ames試驗的暴露裝置其原理和裝置構造與細胞暴露的相似，只是用培育有細菌的培養(yǎng)皿代替種植細胞的transwell小室，直接將培養(yǎng)皿置于煙氣暴露腔中進行煙氣暴露，暴露一定時間后，將培養(yǎng)皿取出繼續(xù)進行Ames試驗[22]。

1.1.2 應用研究

國外各研究機構關于Cultex和Vitrocell暴露裝置在煙草煙氣毒理學評價中的可行性研究和應用研究較為深入和全面，并取得了較好結果。Roper等研究了全煙氣暴露對細胞的溶酶體活性（中性紅攝入法）和代謝活性（MTS代謝活性法）的影響，測試結果顯示全煙氣暴露方法可行，數(shù)據(jù)可靠[9]。Eguchi等使用Cultex暴露裝置研究了不同卷煙煙氣對A549人肺上皮細胞的毒性作用，得出結論全煙氣暴露裝置是評價卷煙煙氣生物學活性的有效方式[10]。Fukano等使用Cultex暴露裝置得到的細胞毒性試驗結果表明，煙氣對哺乳動物細胞的作用大小主要由抽吸口數(shù)和煙氣濃度決定[12]。Nishino等利用Cultex暴露裝置研究了傳統(tǒng)煙氣捕集方法所忽略的煙氣組分-非水溶性氣相物，并用中性紅攝入法評價了非水溶性氣相物的細胞毒性[13]；此外，他們還利用Cultex全煙氣暴露裝置進行了全煙氣暴露下體外微核法的研究，結果表明全煙氣暴露下誘發(fā)的細胞微核率明顯高于傳統(tǒng)捕集方法萃取得到的煙氣樣品所誘發(fā)的細胞微核率[14]。Aufderheide等應用全煙氣暴露法研究了卷煙煙氣對于鼠傷寒沙門氏菌的誘變性，結果顯示，相比較于傳統(tǒng)的煙氣測試方法，全煙氣暴露下細菌誘變的敏感性提高了[15]。Ritter等采用全煙氣暴露法比較了不同卷煙煙氣的細胞毒性情況，結果表明全煙氣暴露法在評價不同類型卷煙的細胞毒性差異方面具有可行性[23]。Olivera等研究發(fā)現(xiàn)，全煙氣暴露下人支氣管上皮細胞的緊密連接結構及其通透性發(fā)生改變[24]。Roller等應用Ames試驗結合全煙氣暴露法，對6種卷煙煙氣的致突變性數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計和分析，結果表明全煙氣暴露法適用于卷煙煙氣的致突變性評價[25]。

1.1.3 優(yōu)缺點

此類暴露裝置在煙草全煙氣分析及環(huán)境氣體分析中有著廣泛的應用，已經(jīng)商品化，裝置和使用方法較為規(guī)范，并且能夠同時實現(xiàn)貼壁培養(yǎng)細胞、組織以及細菌的直接暴露，檢測結果具有劑量-反應關系。但是，此類暴露裝置價格昂貴，普通實驗室難以負擔，這也在一定程度上限制了此類裝置的推廣和普及。

1.2 BAT公司的氣液界面接觸式煙氣暴露方式

1.2.1 暴露原理

BAT公司（British American Tobacco）自行開發(fā)設計了用于細胞毒性測試的連接吸煙機的細胞暴露裝置[16]，見圖2，其暴露原理同Cultex的細胞暴露原理基本相同，細胞種植于transwell小室（porous transwellTM）的半透膜上，其下以一定流速的培養(yǎng)液為其提供基本生活條件，細胞位于氣-液界面上暴露，煙氣直接接觸細胞，從而實現(xiàn)全煙氣暴露。

1.2.2 應用研究

BAT公司使用此暴露裝置，將人肺上皮細胞暴露于卷煙全煙氣中，研究了卷煙全煙氣對人肺上皮細胞的毒性作用[26]，并且通過此煙氣暴露裝置研究了卷煙全煙氣的生成及評價方面的注意事項[27]。Massey等將哺乳動物細胞暴露于3R4F卷煙的一系列稀釋煙氣后用體外微核試驗（雙核法）來檢測，發(fā)現(xiàn)細胞毒性與稀釋劑量有相關性，而微核誘導作用明顯缺乏劑量響應[11]。

圖2 BAT公司全煙氣細胞暴露裝置示意圖（圖片摘自文獻[16]，略作修改）

1.2.3 優(yōu)缺點

BAT公司自行開發(fā)的全煙氣暴露裝置構造簡單、結構合理，和Cultex和Vitrcell一樣，采用了transwell小室來實現(xiàn)細胞的培養(yǎng)，可以達到全煙氣暴露實驗的要求，有很好的應用前景。

1.3 Battelle公司的氣液界面接觸式煙氣暴露方式

1.3.1 暴露原理

美國Battelle公司實驗室用細胞培養(yǎng)瓶改裝制作了簡單且易操作的全煙氣暴露裝置[16]，如圖3所示，細胞貼壁培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶中，用潔凈空氣稀釋的煙氣以一定流速通入種有細胞的培養(yǎng)瓶中，振蕩器左右振蕩一定的角度使培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液左右流動從而使細胞與煙氣進行直接接觸暴露，達到全煙氣直接暴露的目的。暴露一定時間后，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，進行細胞毒性試驗。在這種暴露方式中，煙氣并不是完全直接和細胞接觸，會有部分培養(yǎng)液殘留，從而煙氣會有部分在培養(yǎng)液中，細胞的暴露方法介于Cultex和IT公司開發(fā)的裝置（見2.1）的暴露方式之間。

1.3.2 應用研究

盧斌斌等采用Battelle公司裝置進行了全煙氣暴露法研究，比較了3種不同焦油含量的卷煙煙氣的細胞毒性[21]，見圖4。在該研究中，暴露時間為60 min，每個樣品通過調節(jié)空氣與煙氣的稀釋比例暴露6個濃度（15～150μg/L），每個濃度6個平行樣品，6個對照樣品。整個暴露過程根據(jù)監(jiān)測的TPM/L值進行控制。暴露結束后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液換成新鮮的培養(yǎng)液，并置于CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h。對照為6個通入潔凈空氣并經(jīng)過相同條件培養(yǎng)的平行樣品。測試結果顯示，隨著煙氣暴露濃度的增大，卷煙煙氣引起細胞死亡數(shù)量增大。上述研究結果提示，Battelle公司暴露裝置可用于卷煙煙氣的細胞毒性評價。

圖3 Battelle公司自行改裝的全煙氣暴露瓶（圖片摘自文獻[16]，略作修改）

圖4 鄭州煙草研究院的全煙氣暴露裝置（圖片摘自文獻[21]）

1.3.3 優(yōu)缺點

由細胞培養(yǎng)瓶改造而成的全煙氣暴露裝置結構簡單、易操作，在普通實驗室內即可實現(xiàn)，可以滿足實驗室簡單的細胞全煙氣暴露的相關研究。由目前的研究內容來看，該暴露裝置僅限于煙氣對細胞的影響作用研究，未見更為系統(tǒng)和深入的文獻報道。

2 氣液兩相接觸式煙氣暴露方式

關于氣液兩相接觸式煙氣暴露方式，目前僅見IT公司的報道。

2.1 暴露原理

IT公司設計和制作了直接將96孔細胞培養(yǎng)板進行全煙氣暴露的裝置[16]，如圖5所示，細胞貼壁生長在96孔細胞培養(yǎng)板的每個培養(yǎng)孔底部，經(jīng)清潔空氣稀釋后的煙氣通過類似煙氣注射的方式通到每個培養(yǎng)孔中，暴露一定時間后，將96孔細胞培養(yǎng)板取出后繼續(xù)培養(yǎng)，進行中性紅細胞毒性試驗。這種暴露方式和Cultex不一樣，煙氣是通過培養(yǎng)液中與細胞接觸，從而實現(xiàn)全煙氣的暴露。

圖5 IT公司全煙氣細胞暴露裝置示意圖（圖片摘自文獻[16]，略作修改）

2.2 應用研究

Wieczorek等應用上述裝置，將培養(yǎng)有人肺上皮細胞的96孔細胞培養(yǎng)板直接暴露于全煙氣中，證明了96孔細胞培養(yǎng)板用于全煙氣暴露的可行性[28]。Achard等應用上述裝置研究了不同卷煙的全煙氣毒性，采用中性紅攝入法比較了其細胞毒性，并用彗星試驗比較了其遺傳毒性，研究了濾嘴對于煙氣毒性的影響,結果表明，中性紅攝入法和彗星試驗結合全煙氣暴露裝置可以有效評價不同卷煙煙氣的細胞毒性和遺傳毒性[29]。

2.3 優(yōu)缺點

IT公司開發(fā)的全煙氣暴露裝置專用于96孔細胞培養(yǎng)板中細胞的全煙氣直接暴露，操作簡單，對設備要求也不是很高，而且因為直接使用96孔細胞培養(yǎng)板暴露，對煙氣暴露試驗的后期中性紅攝入法處理比較方便。

3 煙氣暴露量的控制及表征

在全煙氣暴露裝置中，煙氣的暴露劑量控制非常關鍵[30]。在Cultex和Vitrocell暴露裝置中，煙氣的暴露劑量通過稀釋分配系統(tǒng)控制。吸煙機抽吸卷煙產(chǎn)生的新鮮煙氣以一定的抽吸容量被壓入稀釋系統(tǒng)中，經(jīng)流速恒定的清潔空氣稀釋后以一定的速度經(jīng)過暴露腔。清潔空氣的流速由氣體流量控制器和真空管控制，經(jīng)過暴露腔的經(jīng)清潔空氣稀釋的煙氣流速由真空泵產(chǎn)生的負壓和氣體流量控制器控制。

煙氣暴露劑量根據(jù)進入暴露腔中的量計算，根據(jù)公式1以煙氣百分比表示。公式中的分子是最終經(jīng)過暴露腔的煙氣流速；分母是煙氣和清潔空氣的流速，即經(jīng)過稀釋系統(tǒng)的總煙氣的流速。

公式1（摘自文獻[22]）：

美國Battelle公司的全煙氣暴露裝置煙氣暴露劑量是通過不同流速潔凈空氣對主流煙氣進行稀釋從而使細胞暴露于不同濃度的煙氣實現(xiàn)的。煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物（TPM）濃度為指標進行控制[21]。在ISO標準條件下抽吸卷煙，產(chǎn)生的主流煙氣用潔凈空氣稀釋，稀釋后的煙氣直接導入盛有細胞的培養(yǎng)瓶中。煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物（TPM）濃度為指標進行控制。

4 全煙氣暴露試驗的重要影響因素分析

由于Cultex暴露裝置被廣泛應用于揮發(fā)性物質毒理研究和環(huán)境空氣的研究，對其的研究較為系統(tǒng)深入，Aufderheide等對Cultex暴露系統(tǒng)進行了長達十年的研究，發(fā)表了許多研究論文，內容涵蓋全煙氣暴露試驗的重要影響因素研究、應用Cultex暴露裝置進行混合氣體和煙氣的毒理學研究等。

4.1 空氣流速

Aufderheide等使用Cultex暴露裝置，研究了空氣流速對細胞存活率的影響[8]。將人肺成纖維細胞暴露于含有20.5%的氧氣和氮氣組成的空氣中5-120 min，流速分別為 667、33、16.7、12.7和 8.3 mL/min，反應條件為25℃，90%相對濕度，沒有二氧化碳。結果顯示，隨著測試氣體流速的降低，細胞存活率急劇升高。由此可見，氣體流速會對細胞的存活率產(chǎn)生一定的影響。因此，進行煙氣暴露試驗時應充分考慮煙氣的通入速率。

4.2 試驗溫度

Knebel等研究發(fā)現(xiàn)在復雜氣體暴露試驗中，全煙氣暴露系統(tǒng)中的反應腔溫度由25℃提高到37℃時，由于清潔空氣會產(chǎn)生較大的蒸發(fā)，引起了細胞存活率的降低[31]。因此，進行煙氣暴露試驗時應充分考慮溫度對暴露體系和檢測結果的影響。

4.3 Ames試驗中頂部培養(yǎng)層的厚度

Aufderheide等發(fā)現(xiàn)在細菌回復突變試驗研究中，細菌存活率和頂部培養(yǎng)層體積呈正相關性，即隨著頂層培養(yǎng)基體積的增大，細菌存活率隨著升高。通過分析還發(fā)現(xiàn)直接涂布法和瓊脂覆層法對陽性結果有較大影響，并且可以得到結論：用瓊脂覆層法比直接涂布法獲得陽性反應結果較少，兩者區(qū)別明顯[32]。

4.4 吸煙機和暴露裝置間的距離

Aufderheide等認為由于煙氣成分復雜，在其產(chǎn)生后有可能發(fā)生各種組分間的化學反應，為避免煙氣老化，最好能在煙氣產(chǎn)生的10秒內到達暴露腔內[8]。

4.5 Ames試驗測試菌株的質粒

Aufderheide等研究發(fā)現(xiàn)，質粒PKM101對測試菌株的回復突變有著重要作用。在檢測全煙氣的致突變性時，質粒pKM101是必需的，在移碼突變中的作用比在錯義突變中的更大[32]。

4.6 代謝活化系統(tǒng)S9

Aufderheide等在細菌回復突變試驗研究中發(fā)現(xiàn)，同一平行試驗中，是否加入30%的S9，對陽性結果有著顯著影響，其陽性結果中細菌回復突變數(shù)的差距可達數(shù)十倍[32]。

從以上的分析可以看出，全煙氣暴露試驗中存在著較多的影響因素，因此在進行全煙氣暴露試驗設計時，應充分考慮上述影響因素對檢測體系和結果的影響。

5 討論與展望

在全煙氣暴露方法中，煙氣暴露量的控制和監(jiān)測是一個研究難點，各國科學家正在努力攻關[8,22,27,34]。目前所采用的方法主要是分別對煙氣的粒相成分和氣相成分以及其他煙氣中的單一物質（例如甲醛等）進行測定，但不能實現(xiàn)全煙氣暴露量的在線實時監(jiān)測。德國CULTEX實驗室研究人員對Cultex暴露裝置的煙氣沉降以及煙氣濃度監(jiān)測進行了大量研究，例如為測定粒相物在細菌平皿中的沉降情況，采用將劍橋濾片捕集的粒相物經(jīng)甲醇萃取后測定萃取液的Ex/Em（355nm/485nm）值，結果表明，粒相物在細菌平皿中的沉降效率取決于暴露小室內的氣體流速；使用散射光裝置和一氧化碳和/或二氧化碳（CO和/或CO2）分析儀分別在線監(jiān)測了在Cultex暴露裝置中卷煙側流煙氣的粒相物和CO和/或CO2（用來表征氣相物）的濃度，結果表明，實驗過程中不同稀釋倍數(shù)的側流煙氣的濃度具有重復性和穩(wěn)定性[17,22,35,36]。在CORESTA體外毒理學小組2011年4月和10月兩次會議上，各家實驗室對全煙氣暴露中使用散射光裝置或CO分析儀以及其他煙氣中的單一物質監(jiān)測煙氣濃度進行了討論。隨著各實驗室研究的深入，研究人員可以緊密跟蹤并了解這個新領域新方向的研究進展情況。

總之，盡管全煙氣暴露方法還存在很多需要改進和優(yōu)化的地方，但作為一種比傳統(tǒng)方法更為客觀和直接的卷煙煙氣暴露方式，相信該方法會在不久的將來，被越來越多的煙草公司、研究機構和檢測機構所關注，使該方法能更好地為低危害卷煙毒理學評價和煙用添加劑安全性評價服務。

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