張鵬，黃啟來，華子春，3

(1.澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，澳門中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門;2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116;3.南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇南京 210093)

胸腺肽(thymopeptide)是一類胸腺上皮細胞產(chǎn)生的對淋巴細胞的分化、成熟和免疫活性具有重要作用的多肽激素的總稱，又稱胸腺激素或胸腺素。1961年Miller和Archer分別在小鼠和家兔中首次發(fā)現(xiàn)。隨后許多學(xué)者從小牛、豬的胸腺或者血清中分離得到胸腺肽[1]。利用等電聚焦凝膠電泳的方法可將胸腺肽分為 α1-10(PI＜5)、β1-5(5.0 ＜PI＜7.0)、γ(7.0 ＜PI)[2]。胸腺肽α1為胸腺肽α家族中的一員。近年來由于其具有較高的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性等而受到極大關(guān)注。

1 胸腺肽α1的理化性質(zhì)

胸腺肽α1由28個氨基酸組成，其氨基酸序列為Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn，分子式 C129H215N33O55，分子 量3108.37，PI為4.2。它是一種針對T細胞的免疫增強劑[1]。分子中不含半胱氨酸，因此無二硫鍵。胸腺肽α1無糖基化，唯一的修飾是N-端的乙?；阴；拇嬖谂c否對Tα1生物活性并無顯著影響[3]。體外生物活性測定表明，Tα1的活性為TF5(胸腺五肽)的10 ～1 000 倍，且更耐酸、耐堿、耐熱[4-5]。

Tα1空間結(jié)構(gòu)與介質(zhì)相關(guān)。在水中，Tα1并不以其優(yōu)勢構(gòu)象存在。在有雙十四烷基磷脂酰膽堿(DMPC)與二羥甲基丙酸(DMPA)(10∶1)的單層脂質(zhì)體和十二烷基磺酸鈉(SDS)存在時，部分Tα1呈現(xiàn)有序的空間構(gòu)象，一定濃度的鋅離子會起到同樣的作用。核磁光譜實驗結(jié)果表明，在疏水性較強的三氟乙醇(TFE)水溶液中，Tα1出現(xiàn)2個特征區(qū)域:在第5和第8個氨基酸殘基之間出現(xiàn)一個β轉(zhuǎn)角，而在第17和第24氨基酸殘基之間呈現(xiàn)一個α螺旋構(gòu)型。Tα1這種隨介質(zhì)而變化的構(gòu)象可能是它與淋巴細胞膜相互作用所必需的，與Tα1調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中淋巴細胞激活的引發(fā)有關(guān)[6]。

2 臨床應(yīng)用

2.1 Tα1可用于癌癥患者手術(shù)或放化療后的康復(fù)

癌癥患者在接受手術(shù)或者放化療后免疫系統(tǒng)會受到不同程度的損傷，免疫調(diào)節(jié)劑Tα1可以降低血液及神經(jīng)毒性，有助于免疫抑制的逆轉(zhuǎn)，推遲復(fù)發(fā)時間和延長存活時間。Salvati等[7]將22例晚期非小細胞肺癌患者隨機分為兩組，一組接受化療(環(huán)磷酰胺)，另一組化療后使用Tα1加低劑量IFNα。結(jié)果表明，化學(xué)免疫治療比單純化療的響應(yīng)率有所增加(分別為33%和10%)。單純化療組經(jīng)過兩個周期的化療，CD4+、CD8+和NK細胞數(shù)量顯著下降，而在化療免疫治療的患者中CD4+、CD8+和NK細胞數(shù)量在治療前后無明顯差異，且化療免疫治療可以降低患者血液學(xué)毒性。放療法治療肺癌會導(dǎo)致肺部的損傷，使用Tα1可以緩解射線對肺部的急慢性損傷[8]。使用Tα1還可以降低化療對癌癥患者的神經(jīng)毒性[9]。Shuqun等[10]考察了Tα1對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)防作用，發(fā)現(xiàn)肝部經(jīng)皮肝動脈化療栓塞術(shù)TACE和Tα1聯(lián)合使用雖然不能降低復(fù)發(fā)率，但是可以推遲復(fù)發(fā)時間和延長存活時間。Naylor等[11]發(fā)現(xiàn)Tα1可能對放療和化療導(dǎo)致的免疫抑制的逆轉(zhuǎn)有重要作用。

惡性膠質(zhì)瘤患者一般會在確診后12個月內(nèi)死亡，使用促炎癥細胞因子如IL-2或者 IL-12可以延長患者的生命。Tα1作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，可以用于促進IL-2分泌和T細胞增殖。Sungarian等[12]研究了Tα1對惡性膠質(zhì)瘤患者的影響，同時研究了Tα1的體外抗腫瘤效果。研究結(jié)果表明，Tα1或者BCNU(卡莫司汀)處理可以使腫瘤明顯減小。體外實驗結(jié)果顯示，Tα1對存活率和線粒體功能無直接影響，相反，它增加了促凋亡基因包括FasL、FasR和TNFα-R1的表達，提高了小鼠膠質(zhì)瘤細胞9L對氧化壓力及顆粒酶B和BCNU誘導(dǎo)死亡的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)表明，Tα1可以通過對促凋亡機制的激活而有助于BCNU介導(dǎo)的惡性膠質(zhì)瘤的治療，使瘤細胞對氧化壓力以及顆粒酶B和化療藥物更加敏感。Perruccio等[13]通過臨床實驗證實，惡性血液病患者接受HLA單倍體相合的干細胞移植后，使用Tα1不會引起急、慢性的宿主免疫排斥，可顯著改善多核細胞和樹突細胞的功能，增加T細胞的數(shù)量以及使功能性抗原特異性T細胞反應(yīng)提早出現(xiàn)。Tα1與達卡巴嗪 (DTIC)和IFN-α聯(lián)合使用治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤也具有較好的效果[14]。

2.2 Tα1可用于膿毒血癥的治療

膿毒血癥(pyemia)是指化膿性細菌侵入血液后大量繁殖，并通過血流擴散至宿主體的其他組織或器官，產(chǎn)生新的化膿性病灶。目前膿毒血病的治療方法是使用高劑量的皮質(zhì)甾類和非甾醇類抗炎藥，但此法對提高存活率并不明顯。Chen等[15-16]隨機選取114位嚴重膿毒血癥臨床患者。59位患者同時使用了Tα1和UTI(烏司他丁)進行聯(lián)用治療(A組)，55位患者僅使用安慰劑(B組)。通過兩組的比較，A組患者在治療后很快顯示出器官衰竭方面的好轉(zhuǎn)，并且在觀察期表現(xiàn)出較好的器官衰竭的恢復(fù)。在治療開始后CD4+/CD8+比例明顯提高，促炎細胞因子如腫瘤壞死因子、IL-6，抗炎細胞因子包括IL-4、IL-10快速達到平衡。其28 d存活率提高17.3%，60 d存活率提高28.9%，90 d存活率提高31.4%。病死率降低的同時縮短在重癥監(jiān)護室的時間、使用呼吸機的時間和使用抗微生物和多巴胺治療的時間。因此，使用Tα1和UTI聯(lián)用治療可以提高膿毒血癥患者的存活率[17]。Tα1和血液純化(CBP)聯(lián)合使用也能夠顯著提高嚴重膿毒血癥患者的細胞免疫力，促進器官功能的恢復(fù)。組合治療可以使治療更加有效[18]。使用Tα1聯(lián)合青霉素以及烏司他丁也可以使膿毒血癥患者的存活率升高[19]。

2.3 Tα1可用于治療乙型肝炎

乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種傳染病。乙型肝炎廣泛流行于世界各國，主要侵犯兒童及青壯年，主要通過血液、母嬰和性接觸進行傳播。少數(shù)乙型肝炎患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌，多數(shù)無癥狀，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)?，F(xiàn)在還沒有什么特效藥。為了研究Tα1胸腺肽在乙肝治療方面的效果，Chien等[20]招募了98位通過臨床病理學(xué)證明的乙肝患者，并將其隨機分為3組:A組接受26周每周2次1.6 mg·次－1胸腺肽的皮下注射;B組的治療方法與A組相同，只是要接受52周的治療;C組作為對照組，18個月不進行特別的治療。3組患者在開始的臨床病理學(xué)指標上相當。治療結(jié)束后，A組(40.6%)和B組(26.5%)的完全病毒學(xué)應(yīng)答率要比C組(9.4%)高，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。病理學(xué)評價顯示治療組在小葉壞死性感染和纖維化上有明顯改善。這些結(jié)果表明，26周的Tα1的治療對慢性乙肝患者是安全有效的。對于HBsAg、anti-HBe、HBV-DNA陽性乙肝，目前沒有一種有效的治療方法。Rasi等[21]通過臨床實驗證實，在抗HBe、HBV-DNA陽性的慢性乙肝患者中，單獨的Tα1治療不能增加病毒響應(yīng)速度，但是有助于減少免疫介導(dǎo)的肝細胞壞死。Lim等[22]進行了一個雙盲、隨機和安慰劑作為對照的臨床試驗以比較5 mIU干擾素結(jié)合Tα1(1.6 mg·次－1，3次·周－1)和 5 mIU 干擾素加安慰劑的治療效果。實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合治療后HBeAg轉(zhuǎn)陰的比例比單獨治療高出17.8%。毛海鷹等[23]也通過臨床實驗證明，聯(lián)合使用Tα1和IFN效果好于單獨使用IFN。此外，單獨使用Tα1能夠顯著增加乙肝患者抗病毒蛋白的合成，刺激細胞因子的分泌[24]，而與IFNα聯(lián)合使用可以刺激IL-2的合成，但是抑制IFN誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生[25]。Tα1還能夠降低抗 HBe陽性的慢性肝炎患者HBV的復(fù)制。此外，與IFNα相比，Tα1具有更好的耐受性?？傊?，Tα1是一種安全有效的治療抗HBe陽性慢性肝炎的替代品[26]。蔣濱[27]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用胸腺肽和抗乙肝免疫核糖核酸(IRNA)可以顯著提高HBeAg及HBV-DNA陰性率，其效果明顯優(yōu)于單獨使用其中一種藥物。

2.4 Tα1 可用于治療丙肝

丙型病毒性肝炎是由丙肝病毒(HCV)所引起的，是以肝臟損害為主的一組全身性傳染病。近年來我國的丙肝發(fā)病率及死亡率急速上升，危害性日趨嚴重。2009年報告的發(fā)病人數(shù)是2003年的6倍多，死亡率竄升到傳染性疾病第5位。我國約有丙肝患者4 000萬。80%的急性丙肝患者沒有明顯癥狀，高達50%～85%的急性患者會轉(zhuǎn)為慢性丙肝，20年后部分慢性患者發(fā)展成嚴重的肝硬化，甚至肝癌。目前丙肝無疫苗可預(yù)防，一旦感染丙肝，僅有20%患者自發(fā)清除病毒，隱匿的丙肝患者會成為危險的傳染源。

目前，治療丙肝的標準方案是聚乙二醇干擾素和病毒唑聯(lián)用，一些患者如果沒有成功清除病毒，再次治療的效果仍然不令人滿意。Tα1作為一種免疫調(diào)節(jié)劑可以用作丙肝的輔助治療，尤其是一些難以治愈的病例。Tα1可以導(dǎo)致早期自然殺傷細胞的增加[28]。Th1相關(guān)細胞因子的過表達對丙肝感染的免疫介導(dǎo)的消除起著非常重要的作用。Tα1可以促進T細胞成熟，產(chǎn)生Th1型細胞因子，增強NK細胞介導(dǎo)的細胞毒作用。Tα1還可以增加肝臟的NKT細胞和CD8+細胞毒T淋巴細胞，減少丙肝病毒對肝臟細胞的感染[29]。Th2相關(guān)細胞因子的增加和持續(xù)感染相關(guān)。Tα1處理可以導(dǎo)致IL-2和2'，5'-寡腺苷酸合成酶的顯著增加。單獨用干擾素α處理后，兩者也有較小的增長幅度，而兩者聯(lián)用則可以起到協(xié)同增效的作用。Tα1可以降低IL-4和IL-10的水平，而干擾素α可以增加這些細胞因子的分泌。兩者聯(lián)合使用可以使干擾素α的作用逆轉(zhuǎn)。因此Tα1的使用可以使丙肝病人的Th1型反應(yīng)增強，這對丙肝病毒的清除非常重要，使用Tα1可以降低Th2型反應(yīng)，這與病毒血癥的存留相關(guān)[30]。Sherman等[31]通過臨床試驗證實，干擾素和胸腺肽聯(lián)合使用可提高HCV RNA清除率。

2.5 其他疾病的治療

臨床研究表明，將Tα1和地塞米松聯(lián)用對于特發(fā)性血小板減少性紫癜患者是安全有效的[32];Tα1可以提高患者的免疫力，改善感染性休克患者的免疫功能[33];有效預(yù)防和治療氣管切開術(shù)病人的肺部感染[34];使用Tα1可以增加急性胰腺炎患者的細胞免疫，降低感染率[35];通過增加細胞免疫，防止慢性障礙性肺部疾病的惡化[36];狂犬病疫苗與胸腺肽聯(lián)合使用可以短期(7 d)提高機體γ-干擾素、IL-2和中和抗體水平[37]。

3 市場狀況

1997年美國賽生(Sciclone)公司開發(fā)的胸腺素Tα1獲準上市，并在24個國家批準用于慢性乙型肝炎的治療，在歐、美、日等國家也用于治療丙型肝炎、肝細胞癌及免疫疾病，賽生公司的胸腺肽Tα1已在我國注冊。自20世紀末，賽生公司的產(chǎn)品日達仙進入我國市場以來，以其抗病毒和抗癌癥方面的良好療效，銷售額逐年遞增。2003年北京SARS患者日達仙治療費用在20萬元左右，絕大部分由醫(yī)?；鸾y(tǒng)籌支付。根據(jù)病情輕重及其治療方案不同，治療費用從數(shù)萬元到20多萬元不等。2003年二季度，賽生藥業(yè)銷售收入同比激增3倍，達1 500萬美元。2009年美國賽生藥業(yè)的胸腺肽Tα1銷售額已達7 240萬美元，折合人民幣約4.9億，增長34%。平均每個肝病患者4 500美元的藥費是支撐起這一業(yè)績基礎(chǔ)。公司該產(chǎn)品銷售收入的96%來自我國，即該產(chǎn)品在國內(nèi)的銷售額高達4.7億元。

自2002年起，我國在胸腺肽Tα1開發(fā)方面進展快速，同年10月，SFDA批準四川源基制藥有限公司生產(chǎn)原料藥，成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)1.6 mg粉針劑。隨后，海南雙成藥業(yè)、海南中和藥業(yè)分別獲得了SFDA頒發(fā)的原料藥及注射劑生產(chǎn)批件。

該產(chǎn)品的市場前景很廣闊，在多種病毒性疾病和免疫力低下的疾病中需求巨大，尤其在每年上百萬活動期乙肝患者和各種腫瘤患者中占有很大的份額，。

4 基因工程方法生產(chǎn)胸腺肽

Tα1是Goldstein等通過離子交換層析和過濾從TF5中首次分離得到。目前在中國市場上取得胸腺肽α1批準文號的產(chǎn)品只有美國賽生公司的日達仙、海南雙城的基泰、海南中和的和日和成都地奧的邁普欣。這些企業(yè)均通過化學(xué)合成方法生產(chǎn)。化學(xué)合成胸腺肽由于產(chǎn)率較低，致使其成本較高，而且作為進口藥品，日達仙一直享受單獨定價的權(quán)利，價格大約是國內(nèi)仿制藥的五倍，相應(yīng)增加了患者的費用，使其臨床應(yīng)用受到了限制。

為了滿足日益增長的臨床需求，降低患者的費用，需要發(fā)明一種新工藝以提高胸腺肽的生產(chǎn)水平。利用基因工程的方法生產(chǎn)胸腺肽α1具有高效、快速、低成本等優(yōu)點，是一種非常有吸引力的大批量生產(chǎn)的方法。但目前這一方法仍處于研究階段，市場尚無基因工程Tα1上市。

目前，胸腺肽α1在原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)中的表達均有研究。在原核系統(tǒng)中的表達宿主主要集中在大腸桿菌，而在真核系統(tǒng)的表達宿主主要是酵母菌，也有學(xué)者在西紅柿中成功表達Tα1。

4.1 胸腺肽Tα1在原核系統(tǒng)中的表達

Zhang等[38]在hTα1的C端加入6個組氨酸的標簽，得到克隆pET-28a-h Tα1，然后在大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表達，重組蛋白占總蛋白的比例為50%～60%，并采用基于溫度變性的鎳親和層析和高效液相色譜方法進行分離。純化方法具有很高的重現(xiàn)性和易操作性。純化的重組hTα1顯示出高的同質(zhì)性，純度經(jīng)過電泳和HPLC檢測可達到99%。等點聚焦分析顯示其pI值為4.0，全波長掃描分析顯示其最大吸收峰在214 nm。Chen等[39]將Tα1的基因克隆到pET-28a、pET-9c、pThioHis B、pGEX-2T 和 pBV222 5種質(zhì)粒中，然后在大腸桿菌表達，通過比較發(fā)現(xiàn)在BL21/pET-28a表達系統(tǒng)中的產(chǎn)量最高，可以達到細菌總蛋白的70%，并為可溶形式。

由于Tα1編碼的多肽過短，直接表達容易被宿主菌降解，很難利用基因工程的方法實現(xiàn)直接表達，因此在原核系統(tǒng)中的表達目前主要可以采用串聯(lián)體表達和融合表達等方式。

4.1.1 串聯(lián)體表達 Li等[40]將2個Tα1的串聯(lián)體蛋白在大腸桿菌中表達。通過HPLC分析表明，純化后的串聯(lián)體的純度可達到95%以上，并且該串聯(lián)體蛋白可以刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖并能夠增加腫瘤細胞系的凋亡?；铙w條件下串聯(lián)體可以顯著地抑制B16小鼠腫瘤的增長。與Tα1相比串聯(lián)體顯示出更強的生物活性。Chen等[41]根據(jù)植物密碼子偏好性設(shè)計合成了4xTα1基因，并且將其插入到大腸桿菌的表達載體pQE30中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15。4xTα1蛋白在大腸桿菌中以可溶性形式表達，純化后的蛋白通過MTT實驗分析表明，4xTα1蛋白能夠刺激小鼠脾淋巴細胞增殖。這是首次報道根據(jù)植物密碼子偏向性設(shè)計的基因在大腸桿菌中表達，并且為在植物中表達Tα1提供了基礎(chǔ)。

4.1.2 融合表達 Esipov等[42]使用基于 pET32b+質(zhì)粒在大腸桿菌ER2566中的表達系統(tǒng)，以獲得硫氧還蛋白和Tα1的融合蛋白，中間插入了一個TEV的酶切位點。融合蛋白以可溶性的形式過表達，通過離子交換層析純化，通過無水乙酸進行乙?；幚恚缓罄梅聪騂PLC純化。每升發(fā)酵液最終可以獲得29 mg的靶蛋白。此方法簡單而且低成本，是一種適合于大量生產(chǎn)重組Tα1的方法。劉先俊等[43]將Tα1和TNFα1的融合蛋白的DNA序列克隆到pET-22b(+)載體中，在BL21(DE3)-Codonplus-RP-X中表達。表達的產(chǎn)物是一種可溶性的蛋白，其產(chǎn)量大約為總蛋白的20%，經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀和疏水柱層析，最后的純度可以達到96%。經(jīng)鑒定，融合蛋白抗病毒活性強于市售的IFNα1b和IFNα2b。與市售的胸腺肽類似可以刺激胸腺細胞的增殖。融合蛋白顯示較強的抗HBV的活性[43]。

Korobko等[44]將 TNF 和 Tα1 構(gòu)建為重組質(zhì)粒，其重組方式分為兩種，第一種將TNF連接在Tα1的左側(cè)，第二種將TNF連接在Tα1的右側(cè)，并在大腸桿菌中表達重組蛋白。研究發(fā)現(xiàn):重組的蛋白TNF-Tα1被分泌到大腸桿菌的周質(zhì)空間，而重組蛋白Tα1-TNF在細胞中則以不可溶的形式聚集。兩種蛋白經(jīng)不同方式進行純化。融合蛋白TNF-Tα1具有細胞毒實驗的全部生物活性。而重組蛋白Tα1-TNF則只有非常小的生物活性。重組蛋白用溴化氰處理后形成2個多肽的混合物，將此混合物經(jīng)過簡單的柱層析即可分離。Shen等[45]將Tα1和可溶性B淋巴細胞刺激因子融合并在大腸桿菌中過表達。蛋白的分子量為28 kDa。利用Ni柱純化后，融合蛋白具有B淋巴細胞刺激因子的活性并且比Tα1略高。由于具有Tα1和B淋巴細胞刺激因子的雙重功能，此融合蛋白可以用于各種免疫缺陷癥的治療以增強宿主的免疫反應(yīng)。Fedorov等[46]將重組蛋白CNF-T基因克隆在pThy315中，并且在大腸桿菌SG200-50中以包涵體的形式表達，它與其他蛋白以二硫鍵形式結(jié)合形成高分子復(fù)合物。在DDS-Na和DTT中使復(fù)合物變性，然后用葡聚糖G-100凝膠層析進行分離，不含有DDS-Na的純化產(chǎn)物具有很強的對鼠惡性腺瘤L-929細胞的細胞毒性。

4.1.3 與RimJ共表達 生物合成Tα1的障礙除了小肽的表達困難以外，另一方面是N端的乙酰化困難。為了有效獲得N端乙?；腡α1，Ren等[47]構(gòu)建了一個Tα1內(nèi)含肽融合蛋白，其N端與一個最小的迷你內(nèi)含肽融合(Sp1 DnaX)，C端加入了一個His tag。由于Tα1的N端連接了一個內(nèi)含肽融合蛋白，當Tα1內(nèi)含肽融合蛋白與RimJ(真核生物的N端乙?；?共表達時，用β-巰基乙醇或者二硫蘇糖醇以及升高溫度誘導(dǎo)，會導(dǎo)致內(nèi)含肽介導(dǎo)的N端切割。條件優(yōu)化后，1 L發(fā)酵液可以獲得24.5 mg的Tα1，經(jīng)過一系列的純化后，其純度可以達到98%，相對分子質(zhì)量為3 107.44，這與合成的 Tα1分子量非常接近。重組Tα1的氨基酸序列經(jīng)過分析確認，結(jié)果顯示其N端被乙?；?。

4.2 Tα1在真核系統(tǒng)中的表達

Chen等[48]使用人血清白蛋白和Tα1在酵母菌中融合表達，中間無連接肽。然后通過離子色譜等方法純化，產(chǎn)物純度可以達到97%。體外脾淋巴細胞增殖實驗表明，rHSA-L-Tα1不僅具有比Tα1更高的促進脾淋巴細胞成熟的作用，而且可以抑制地塞米松導(dǎo)致的T淋巴細胞的凋亡。在氫化可的松引起的免疫抑制小鼠中的活體實驗中，連續(xù)7 d注射融合蛋白和Tα1，體重凈增長，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯增高，體液中SOD水平升高而MDA水平則下降，藥動學(xué)指數(shù)升高并且半衰期延長。胸腺五肽可以改善免疫失調(diào)患者的免疫系統(tǒng)。然而，其在血漿中的半衰期很短。為了獲得更加穩(wěn)定而且有活性的胸腺五肽類似物，Gao等[49]將Tα1和胸腺五肽融合并且克隆到pGAPZalphaA載體中。融合多肽在酵母中表達并且經(jīng)過金屬螯合層析和凝膠過濾層析純化。圓二色光譜分析發(fā)現(xiàn):融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是一個α螺旋和無規(guī)卷曲。體外分析顯示，融合蛋白的半衰期為(140±14)min，比胸腺五肽的半衰期[(5.6±0.7)min]以及 Tα1的半衰期[(127±11)min]長。體外活性實驗表明，融合蛋白可以促進昆明鼠脾細胞的增殖，并且其促使吞噬細胞和巨噬細胞分泌IL-2的能力比單獨使用Tα1和 TP5都要強[49]。Chen等[50]構(gòu)建了一個Tα1酵母表達系統(tǒng)，首先將Tα1克隆到酵母pYES2載體，然后將pYES2-Tα1轉(zhuǎn)入酵母，用乳糖代替葡萄糖以誘導(dǎo)Tα1的表達。通過Western blotting確認Tα1正確表達后，用此干酵母飼喂Balb/c小鼠(其免疫系統(tǒng)被環(huán)磷酰胺抑制)，用合成的Tα1作為正對照，空載的酵母作為負對照。合成的Tα1和含有pYEST2-Tα1的干酵母均可以增加CD8+細胞的水平。黃雯等[51]根據(jù)酵母密碼子偏向性設(shè)計 hTα1基因，利用over lapping PCR技術(shù)將其與核糖體蛋白基因的5'端進行連接，然后插入pPIC載體，并通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入HIS4突變菌株GS115。SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果表明融合蛋白表達成功，其表達水平為25 mg·L－1。Yang等[52]利用PCR和分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了IFNalpha2b-(G4S)n-Tα1(n=1-3)融合基因并將其克隆到真核表達系統(tǒng)pPIC9中。在酵母中表達得到融合蛋白，利用DEAE親和層層技術(shù)，Superdex75凝膠過濾進行純化。使用抗病毒和E-玫瑰花結(jié)實驗分析發(fā)現(xiàn)，純化的融合蛋白顯示出抗病毒和增加E玫瑰花結(jié)的能力。Chen等[53]根據(jù)植物密碼子使用偏向性設(shè)計并合成了Tα1基因，基因由4個Tα1首尾相接。將其克隆到植物偏向性表達載體PG-pRD12中，然后通過根癌膿桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入西紅柿。通過篩選獲得了54株卡那霉素抗性的植株。其中4株通過RT-PCR分析顯示，4xTα1基因在西紅柿果實中發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。ELISA分析表明，在成熟的果實中 4xTα1 蛋白的濃度可以達到 6.098 μg·g－1。Western blotting結(jié)果進一步證實，4xTα1在轉(zhuǎn)基因西紅柿果實中表達。MTT實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因西紅柿中的4xTα1蛋白具有刺激小鼠脾淋巴細胞體外增殖的能力，這是首次報道Tα1在植物中表達。

5 展 望

隨著胸腺肽α1作用機制的深入研究，其臨床應(yīng)用必定會更加廣泛，市場需求也會進一步擴大。胸腺肽的基因工程生產(chǎn)方法以及新的更加有效的分離純化方法逐漸走向成熟，必將會以其高效、快速、低成本等優(yōu)勢替代化學(xué)合成的胸腺肽成為市場的主流。

[1]GOLDSTEIN A L，GUHA A，HARDY M A，et al.Purification and biological activity of thymosin，α hormone of the thymus gland[J].Proc Natl Acad Sci USA，1972，69(7):1800-1803.

[2]HOOPER J A，MCDANIEL M C，THUMRAN G B，et al.Purification and properties of bovine thymosin[J].Ann NY Acad Sci，1975，249:125-144.

[3]宮照龍.胸腺素alpha-1基因的克隆、表達及其對淋巴細胞增殖的影響[D].安徽醫(yī)科大學(xué)，2004.

[4]GOLDSTEIN A L，LOW T L K，MCDOO M，et al.Thymosinα1:isolation and sequence analysis of an immunologically active thymic polypeptide[J].Pro Natl Acad Sci USA，1977，74(2):725-729.

[5]LOW T L K，GOLDSTEIN A L.Thymosins:structure，function and therapeutic applications[J].Thymus，1984，6:27-42.

[6]GROTTESI A，SETTE M，PALAMARA T，et al.The conformation of peptide Tα1 in solution and in a membrane-like environment by circular dichroism and NMR spectroscopy.A possible model for its interaction with the lymphocyte membrane[J].Peptides，1998，19(10):1731-1738.

[7]SALVATI F，RASI G，PORTALONE L，et al.Combined treatment with thymosin-alphal and low-dose interferon-alpha afterifosfamide in non-small cell lung cancer:a phase-II controlled trial[J].Anticancer Res，1996，16(2):1001-1004.

[8]余榮，孫宇，蔡慶，等.胸腺肽減輕放射性肺損傷[J].中國肺癌雜志，2011，14(3):187-193.

[9]安彤同，劉敘儀，方健，等.胸腺肽α1治療化療所致神經(jīng)系統(tǒng)副作用的初步研究[J].癌癥，2004，23(11 Suppl):1428-1430.

[10] SHUQUN C，MENGCHAO W，HAN C，et al.Combination transcatheter hepatic arterial chemoembolization with thymosin alphal on recurrence prevention of hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology，2004，51(59):1445-1447.

[11]NAYLOR P H，HADDEN J W.Preclinical studies with IRX-2 and thymosin alphal in combination therapy[J].Ann NY Acad Sci，2010，1194:162-168.

[12]SUNGARIAN A，CIELO D，SAMPATH P，et al.Potential role of thymosin-alphal adjuvant therapy for glioblastoma[J].J Oncol，2009，2009:302084.

[13]PERRUCCIO K，BONIFAZI P，TOPINI F，et al.Thymosin alphal to harness immunity to pathogens after haploidentical hematopoietic transplantation[J].Ann N Y Acad Sci，2010，1194:153-161.

[14]MAIO M，MACKIEWICZ A，TESTORI A，et al.Large randomized study of thymosin alpha 1，interferon alfa，or both in combination with dacarbazine in patients with metastatic melanoma[J].J Clin Oncol，2010，28(10):1780-1787.

[15]CHEN H，HE M Y，LI Y M.Treatment of patients with severe sepsis using ulinastatin and thymosin alphal:a prospective，randomized，controlled pilot study[J].Chin Med J(Engl)，2009，122(8):883-888.

[16]黃順偉，管向東，陳娟，等.烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1改善膿毒癥患者免疫功能的作用機制研究[J].中國病理生理雜志，2009，25(11):2168-2172.

[17]LI Y M，CHEN H，LI X，et al.A new immunomodulatory therapy for severe sepsis:ulinastatin plus thymosin alpha 1[J].J Intensive Care Med，2009，24(1):47-53.

[18]黃順偉，管向東，陳娟，等.創(chuàng)傷性嚴重膿毒癥和多器官功能障礙綜合征免疫調(diào)理治療的臨床研究和遠期評價[J].中國危重病醫(yī)學(xué)，2006，18(11):653-656.

[19]ZHANG Y，CHEN H，LI Y M，et al.Thymosin alphal-and ulinastatin-based immunomodulatory strategy for sepsis arising from intra-abdominal infection due to carbapenem-resistant bacteria[J].J Infect Dis，2008，198(5):723-730.

[20]CHIEN R N，LIAW Y F，CHEN T C，et al.Efficacy of thymosin alphal in patients with chronic hepatitis B:a randomized，controlled trial[J].Hepatology，1998，27(5):1383-1387.

[21]RASI G，TERZOLI E，IZZO F，et al.Combined treatment with thymosin-alphal and low dose interferon-alpha after dacarbazine in advanced melanoma[J].Melanoma Res，2000，10(2):189-192.

[22]LIM S G，WAI C T，LEE Y M，et al.A randomized，placebocontrolled trial of thymosin-alphal and lymphoblastoid interferon for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].Antivir T-her，2006，11(2):245-253.

[23]毛海鷹，石統(tǒng)東.干擾素聯(lián)合胸腺肽α1治療e抗原陽性慢性乙型肝炎的薈萃分析[J].中國肝病雜志，2011，19(1):29-33.

[24]JIANG Y F，MA Z H，ZHAO P W，et al.Effect of thymosin-α(1)on T-helper 1 cell and T-helper 2 cell cytokine synthesis in patients with hepatitis B virus e antigen-positive chronic hepatitis B[J].J Int Med Res，2010，38(6):2053-2062.

[25]LOGGI E，GRAMENZI A，MARGOTTI M，et al.In vitroeffect of thymosin-alphal and interferon-alpha on Th1 and Th2 cytokine synthesis in patients with eAg-negative chronic hepatitis B[J].J Viral Hepat，2008，15(6):442-448.

[26]ANDREONE P，CURSARO C，GRAMENZI A，et al.A randomized controlled trial of thymosin-alphal versus interferon alfa treatment in patients with hepatitis B e antigen antibodyand hepatitis B virus DNA--positive chronic hepatitis B[J].Hepatology，1996，24(4):774-777.

[27]蔣濱.胸腺肽聯(lián)合抗乙肝免疫核糖核酸治療慢性乙型肝炎的療效觀察[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2009，37(4):282-283.

[28]GRANDINI E，CANNOLETTA F，SCUTERI A，et al.Immunological modifications during treatment with thymosin alphal plus antiviral，therapy in chronic hepatitis C[J].Ann NY Acad Sci，2010，1194:147-152.

[29]SUGAHARA S，ICHIDA T，YAMAGIWA S，et al.Thymosinalphal increases intrahepatic NKT cells and CTLs in patients with chronic hepatitis B[J].Hepatol Res，2002，24(4):346-354.

[30]ANDREONE P，CURSARO C，GRAMENZI A，et al.In vitroeffect of thymosin-alphal and interferon-alpha on Th1 and Th2 cytokine synthesis in patients with chronic hepatitis C[J].J Viral Hepat，2001，8(3):194-201.

[31]SHERMAN K E，SJOGREN M，CREAGER R L，et al.Combination therapy with thymosin alphal and interferon for the treatment ofchronic hepatitis C infection:a randomized，placebo-controlled double-blind trial[J].Hepatology，1998，27(4):1128-1135.

[32]王琳，郭成山，侯明，等.胸腺肽α1聯(lián)合大劑量地塞米松治療慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜的療效分析[J].中華內(nèi)科學(xué)雜志，2007，46(4):274-276.

[33]馬麗娜，陳新月，陳杰，等.胸腺肽α1輔助治療肝硬化自發(fā)性腹膜炎[J].中華肝臟雜志，2007，15(3):225.

[34]黃登鵬，楊鳴，彭衛(wèi)平，等.胸腺肽α1對危重病人氣管切開肺部感染的防治作用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，26(1):128-129.

[35]WANG X，LI W，NIU C，et al.Thymosin alpha 1 is associated with improved cellular immunity and reduced infection rate in severe acute pancreatitis patients in a double-blind randomized control study[J].Inflammation，2011，34(3):198-202.

[36]鄭碧霞，程德云，徐剛，等.胸腺肽α1對慢性阻塞性肺疾病急性加重的預(yù)防作用[J].四川大學(xué)學(xué)報，2008，39(4):588-590.

[37]顧小軍，沈玲，黃英，等.胸腺肽聯(lián)合狂犬病疫苗接種對機體產(chǎn)生γ-干擾素、白細胞介素-2和中和抗體影響的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，31(5):550-554.

[38]ZHANG H Y，CHEN P F，XU J M，et al.Separation and puri-fication ofEscherichia coli-expressed human thymosin-α1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography[J].Protein Expr Purif，2011，77(2):140-145.

[39]CHEN P F，ZHANG H Y，F(xiàn)U G F，et al.Overexpression of soluble human thymosin alpha 1 inEscherichia coli[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2005，37(2):147-151.

[40] LI W，SONG L，WU S，et al.Expression，purification and characterization of a novel soluble human thymosin alphal concatemer exhibited a stronger stimulation on mice lymphocytes proliferation and higher anti-tumor activity[J].Int J Biol Sci，2011，7(5):618-628.

[41]CHEN Y，ZHAO L，SHEN G，et al.Expression and analysis of thymosin alphal concatemer inEscherichia coli[J].Biotechnol Appl Biochem，2008，49(Pt 1):51-56.

[42]ESIPOV R S，STEPANENKO V N，BEYRAKHOVA K A，et al.Production of thymosin alphal via non-enzymatic acetylation of the recombinant precursor[J].Biotechnol Appl Biochem，2010，56(1):17-25.

[43]劉先俊，劉方欣，黎波，等.胸腺素α1與復(fù)合α干擾素融合蛋白的表達及其生物學(xué)活性[J].生物工程學(xué)報，2008，24(7):1168-1173.

[44]KOROBKO V G，BOLDYREVA E F，F(xiàn)ILIPPOV S A，et al.Synthesis of an artificial gene coding for thymosin alphal and its expression inEscherichia colias a hybrid with human tumor necrosis factor[J].Bioorg Khim，1992，18(5):646-659.

[45]SHEN Q，TIAN R，MA W，et al.Construction and expression of a new fusion protein，thymosin alphal-cBLyS，E.coli.[J].Biotechnol Lett，2005，7(3):143-148.

[46]FEDOROV T V，KOROBOV V I，NAZAROV V G，et al.urification of recombinant proteins with an example of tumor necrosis factor thymosin-alphal[J].Prikl Biokhim Mikrobiol，2010，6(2):243-247.

[47]REN Y，YAO X，DAI H，et al.roduction of Nα-acetylated thymosin α1 inEscherichia coli[J].Microb Cell Fact，2011，2:10-26.

[48]CHEN J H，ZHANG X G，JIANG Y T，et al.ioactivity and pharmacokinetics of two human serum albumin-thymosin alphal-fusion proteins，rHSA-Talphal and rHSA-L-Talphal，expressed in recombinant ichia pastoris[J].Cancer Immunol Immunother，2010，9(9):1335-1345.

[49]GAO D，ZHANG X，ZHANG J，et al.Expression of thymosin alphal-thymopentin fusion peptide in Pichia pastoris and its characterization[J].Arch Pharm Res，2008，31(11):1471-1476.

[50]CHEN F，CHEN X M，CHEN Z，et al.Construction and application of a yeast expression system for thymosin alphal[J].Biocell，2005，29(3):253-259.

[51]黃雯，李兆育，金禮吉，等.人胸腺素α1基因在畢赤酵母中的融合表達[J].遺傳，2002，24(6):679-683.

[52]YANG Y F，YUAN H Y，LIU N S，et al.Construction，expression and characterization of human interferon alpha2b-(G4S)n-thymosin alphal fusion proteins in Pichia pastoris[J].World J Gastroenterol，2005，11(17):2597-2602.

[53]CHEN Y，WANG A，ZHAO L，et al.Expression of thymosin alphal concatemer in transgenic tomato(Solanum lycopersicum)fruits[J].Biotechnol Appl Biochem，2009，52(4):303-312.