翟紋靜 郜海燕 陶 菲 穆宏磊 李文娟

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所1，杭州 310021）

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院2，南京 210095）

類脂褐素（Lipofuscin－like pigments，LFLP）是細(xì)胞胞漿內(nèi)的一種棕黃色脂類顆粒，是由膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸和磷脂交聯(lián)形成的一種帶Schiff堿基的熒光性化合物［1］。早在1969年，Tappel等［2］提出了丙二醛與氨基酸反應(yīng)形成脂褐素的熒光類似物。1975年，Maguire等［3］首次發(fā)現(xiàn)在香蕉和桃子果實(shí)成熟及衰老過(guò)程中有類脂褐素的產(chǎn)生，這是首次關(guān)于植物組織中存在類脂褐素的報(bào)道。此后又有一系列的研究探討了荔枝、芒果以及玉米水稻等［4－6］農(nóng)產(chǎn)品中類脂褐素隨貯藏時(shí)間的不斷積累，即類脂褐素與衰老有正相關(guān)性。

目前，有關(guān)植物中類脂褐素提取、純化方法的報(bào)道不多，其提取和分析方法基本沿用動(dòng)物和人體相關(guān)的一些方法［7］。關(guān)于山核桃類脂褐素的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)以山核桃為試驗(yàn)材料，研究了這種含油量較高的堅(jiān)果類的類脂褐素的提取及測(cè)定方法。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

山核桃：杭州創(chuàng)輝食品有限公司，選擇大小基本相同，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)裂縫的堅(jiān)果，自然光下曬干（約3個(gè)完整日照），干燥處理至果仁含水量7%～8%；試劑均為分析純。

電子天平：塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；GBC Cintra 20紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)：澳大利亞GBC公司；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；MR23i冷凍離心機(jī)：法國(guó)JOUAN公司；F－7000日立熒光光度計(jì)：日本日立公司。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1 不同溶劑對(duì)類脂褐素的熒光光譜的影響

稱取粉碎的生山核桃仁1 g，分別加入8 mL不同的溶劑：正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、丙酮、甲醇、乙醇、水，于40℃下振蕩提取40 min后，離心收集溶劑層，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，濾液用于熒光分光光度計(jì)分析。激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍300～390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍400～490 nm。

1.2.2 不同提取方式對(duì)類脂褐素提取量的影響

稱取粉碎的生山核桃仁1 g加入8 mL氯仿∶甲醇∶磷酸緩沖溶液（pH 6.0）（2∶1∶1），分別采用靜置、震蕩、超聲以及攪拌不同的提取方式提取60 min，離心收集氯仿層，過(guò)濾后用于熒光分光光度計(jì)分析。激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

在提取試劑及提取方法確定的基礎(chǔ)上，分別考察提取試劑pH、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)山核桃中類脂褐素提取量的影響。每個(gè)試驗(yàn)做3次平行試驗(yàn)。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考察提取液pH、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)類脂褐素提取量的影響，安排4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)見(jiàn)表1，以確定最佳的提取條件參數(shù)。

表1　因素與水平

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果所列的數(shù)據(jù)是3次重復(fù)的平均值。采用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏多重差異分析（P＜0.05）。

2　結(jié)果與討論

2.1　山核桃中類脂褐素的自發(fā)熒光特性

自發(fā)熒光是類脂褐素較為顯著的特性［8］，因此測(cè)定類脂褐素最常用的方法是利用熒光分光光度計(jì)或者熒光顯微鏡，參照其他植物中類脂褐素的測(cè)定［9－12］，確定山核桃中類脂褐素的檢測(cè)范圍，激發(fā)波長(zhǎng)范圍是300～390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍是400～490 nm。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果采用360 nm為激發(fā)波長(zhǎng)；固定激發(fā)波長(zhǎng)，選用400～600 nm范圍掃描發(fā)射光譜。結(jié)果如圖1所示。在氯仿∶甲醇∶磷酸緩沖溶液（2∶1∶1）提取體系中，固定激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)謝波長(zhǎng)430 nm，測(cè)定提取液的熒光強(qiáng)度。用熒光強(qiáng)度表示類脂褐素的相對(duì)含量。

圖1　山核桃中類脂褐素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

2.2　山核桃前處理對(duì)類脂褐素測(cè)定的影響

山核桃中存在其他熒光物質(zhì)，例如多酚類［5，13］、維生素類［14－15］，對(duì)類脂褐素?zé)晒鉁y(cè)定可能會(huì)有干擾，必須在測(cè)定前排除這些熒光物質(zhì)的干擾。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有些多酚物質(zhì)如沒(méi)食子酸、單寧酸有與類脂褐素有類似的熒光光譜，但大多為水溶性而不溶于氯仿；某些維生素類如維生素E、維生素B族有熒光光譜，但是基本不會(huì)對(duì)類脂褐素的測(cè)定造成干擾；脂肪酸類［16］對(duì)類脂褐素的熒光測(cè)定有較大的影響。

對(duì)于山核桃這種含油量較大的樣品來(lái)說(shuō)，脂肪酸等油溶性熒光物質(zhì)對(duì)類脂褐素的測(cè)定影響較大，所以要對(duì)山核桃進(jìn)行脫油前處理以排除油溶性熒光物質(zhì)對(duì)類脂褐素測(cè)定的干擾。采用丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石油醚對(duì)山核桃進(jìn)行脫油，試驗(yàn)結(jié)果表明乙醚的除油效果最好。

山核桃中多酚類物質(zhì)的含量很高，因此在山核桃類脂褐素的測(cè)定中多酚也會(huì)產(chǎn)生干擾，除去多酚類物質(zhì)也是必要的。試驗(yàn)采用混合提取液氯仿∶甲醇∶水（2∶1∶1）提取類脂褐素，離心后對(duì)氯仿層進(jìn)行三氯化鐵反應(yīng)試驗(yàn)［17］檢測(cè)多酚類物質(zhì)是否存在，結(jié)果為陰性表明氯仿層沒(méi)有多酚類物質(zhì)的存在。

采用以上方法可排除山核桃中其他物質(zhì)對(duì)類脂褐素?zé)晒鉁y(cè)定的干擾。

2.3　不同溶劑對(duì)類脂褐素?zé)晒夤庾V的影響

熒光的發(fā)射光譜與物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。采用不同溶劑提取山核桃中的類脂褐素時(shí)，類脂褐素的自發(fā)熒光有所差異，結(jié)果如表2所示。在低極性的有機(jī)溶劑，如正已烷、二氯甲烷、正丁醇中自發(fā)熒光的熒光強(qiáng)度較高；而乙醇、異丙醇、甲醇、水作為溶劑時(shí)，山核桃類脂褐素的熒光強(qiáng)度較低，并且由于特殊溶劑效應(yīng)的存在，隨著溶劑極性的增強(qiáng)，熒光光譜的紅移現(xiàn)象越明顯。乙酸乙酯、丙酮作為提取溶劑時(shí)，在發(fā)射波長(zhǎng)接近400 nm處有較強(qiáng)的脂肪酸熒光干擾，無(wú)法檢測(cè)類脂褐素的熒光強(qiáng)度。

表2　不同有機(jī)溶劑對(duì)類脂褐素?zé)晒夤庾V的影響

考慮提取液分層的優(yōu)劣，并且可以盡可能去除其他雜質(zhì)的干擾，氯仿是最適合的溶劑。

2.4　不同提取試劑pH對(duì)類脂褐素提取量的影響

圖2為不同pH提取條件下山核桃中類脂褐素的熒光強(qiáng)度。pH 1時(shí)，山核桃中類脂褐素的熒光強(qiáng)度較小，隨著pH的升高類脂褐素的熒光強(qiáng)度顯著提高；當(dāng)pH＞5時(shí)，隨著pH的增加類脂褐素的熒光強(qiáng)度有下降趨勢(shì)。較低或較高的pH都不利于類脂褐素提取。這是因?yàn)閜H的變化會(huì)影響有機(jī)物質(zhì)熒光基團(tuán)的酸堿性，在不同pH時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，從而改變物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。因此，在熒光分析中要特別注意控制溶液的pH。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，提取液的pH對(duì)類脂褐素的熒光強(qiáng)度有一定影響，因而試驗(yàn)時(shí)控制溶液在pH 5左右，能得到較高的提取率。

圖2　不同pH提取液對(duì)類脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

2.5　不同提取方式對(duì)類脂褐素提取量的影響

分別采用靜置、震蕩、超聲波不同提取方式的測(cè)定結(jié)果如圖3。

圖3　不同提取方式對(duì)類脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

由試驗(yàn)結(jié)果可知，攪拌、振蕩、超聲提取方式均好于靜置提取，超聲方式提取效率略低，可能是因?yàn)楦邚?qiáng)度超聲可以降解聚合體，對(duì)某些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成一定影響［18］，但是除靜置提取外各種提取方式間差異并不明顯。

2.6　溫度對(duì)類脂褐素提取量的影響

圖4給出了不同提取溫度下山核桃中類脂褐素的熒光強(qiáng)度變化。隨著溫度的升高類脂褐素的提取量也有所增加，但是在一定溫度范圍內(nèi)類脂褐素的提取量無(wú)顯著的變化。溫度在10～40℃范圍內(nèi)時(shí)類脂褐素的提取量保持在一個(gè)較低的水平，隨著溫度的上升提取量變化并不明顯；當(dāng)溫度大于40℃時(shí)，類脂褐素提取量有較為明顯的增加。由于氯仿的沸點(diǎn)是63.3℃，溫度過(guò)高會(huì)造成氯仿的揮發(fā)，所以提取溫度不宜超過(guò)60℃。類脂褐素的提取溫度應(yīng)在40～60℃之間為宜。

圖4　溫度對(duì)類脂褐素提取量的影響

2.7　不同提取時(shí)間對(duì)類脂褐素提取量的影響

不同提取時(shí)間的結(jié)果如圖5所示。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，類脂褐素的提取量呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢(shì)；提取時(shí)間小于1.5 h時(shí)類脂褐素的提取量較低；之后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，類脂褐素的提取量有了明顯的增加，此時(shí)的提取時(shí)間較短，類脂褐素還沒(méi)有被完全提取出來(lái)，時(shí)間越充分類脂褐素的提取量越大。2.5 h后隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，類脂褐素的提取量趨于平穩(wěn)略有下降。這是因?yàn)橐欢螘r(shí)間后，類脂褐素已經(jīng)被充分提取出來(lái)，提取液與山核桃中的類脂褐素濃度達(dá)到了平衡，有效濃度不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

圖5　提取時(shí)間對(duì)類脂褐素提取量的影響

2.8　正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，安排4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果

表4　方差分析

從正交試驗(yàn)直觀分析推測(cè)，各因素對(duì)類脂褐素的熒光強(qiáng)度影響程度依次為：B＞C＞A，即影響類脂褐素提取量的因素依次是：提取溫度＞提取液pH＞提取時(shí)間。影響山核桃類脂褐素提取量的主要因素為提取液的pH和提取溫度，而提取時(shí)間對(duì)類脂褐素提取量的影響并不明顯。進(jìn)一步的方差分析說(shuō)明提取溫度是影響類脂褐素提取效率的顯著因素，而提取時(shí)間和提取液pH是非顯著因素，對(duì)類脂褐素的提取影響不大。因此，在優(yōu)選山核桃類脂褐素提取工藝時(shí)，應(yīng)當(dāng)主要考慮提取溫度。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，山核桃類脂褐素的提取工藝中，最佳的因素組合為A2B3C3，即提取時(shí)間2.0 h，提取溫度為50℃，提取液pH 6.0。

3　結(jié)論

自發(fā)熒光是類脂褐素最顯著的特性，但是在不同溶劑中類脂褐素的熒光光譜有較大的差異，因此選擇合適的溶劑，并采取適當(dāng)?shù)氖侄闻懦蓴_物質(zhì)，是類脂褐素?zé)晒夤庾V法測(cè)定的必要條件。本試驗(yàn)采用氯仿：甲醇：緩沖溶液（2∶1∶1）混合提取試劑對(duì)類脂褐素進(jìn)行提取，并確定山核桃中類脂褐素在該混合提取液中的特征熒光光譜：激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm。正交試驗(yàn)所得的山核桃類脂褐素最佳提取條件為提取時(shí)間2.0 h，提取溫度為50℃，提取液pH 6.0。山核桃類脂褐素提取方法的確立對(duì)研究其在植物衰老過(guò)程中產(chǎn)生機(jī)理有重要作用。

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