王秀麗 張秀香

根據(jù)IDF 2007年第3版Diabetes Atlas統(tǒng)計(jì)中國(guó)糖尿病患者人數(shù)已達(dá)3 980萬(wàn)，預(yù)計(jì)2025年將達(dá)到5 930萬(wàn)［1］，大約1/3的糖尿病患者最終發(fā)展為糖尿病腎病(DN)［2］，DN引發(fā)終末期腎功能衰竭(ESRD)已成為糖尿病患者主要死因［3］。因此對(duì)DN進(jìn)行早期干預(yù)非常重要。蛋白尿作為一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，已經(jīng)成為DN進(jìn)展的一項(xiàng)重要病理特征，臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［4－6］表明腎臟足細(xì)胞(podocyte)的病變是導(dǎo)致蛋白尿的主要原因，包括足細(xì)胞肥大，足突缺失、融合，以及足細(xì)胞從基底膜的分離和凋亡，上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化等。而腎組織nephrin蛋白的表達(dá)水平變化與足細(xì)胞的病變密切相關(guān)［7－9］，本研究在糖尿病大鼠模型基礎(chǔ)上，根據(jù)纈沙坦與貝那普利不同的藥理機(jī)制，對(duì)DN進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)觀察大鼠nephrin表達(dá)的變化，同時(shí)觀察腎組織病理變化，探討纈沙坦與貝那普利聯(lián)合應(yīng)用治療糖尿病腎病的作用機(jī)制及治療優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠24只，體重(200±20)g，普通級(jí)，由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司，10 mg/片)，纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司，80 mg/粒)。

1.2 DN模型建立及分組 將24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、糖尿病組(DN組)、纈沙坦與貝那普利聯(lián)合干預(yù)組(CT組)，每組8只。DN、CT組以10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，行左腎摘除術(shù)。

1.3 方法 常規(guī)消毒，背部切口1～1.5 cm，暴露左腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結(jié)扎左腎門(mén)血管，切除左腎，縫合切口。術(shù)后1周，按體重給予STZ 55 mg/kg(溶解在0.1 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液中，pH值4.2)一次性腹腔注射建立DM大鼠模型(血糖＞16.7 mmol/L，尿糖 +++ ～ ++++)，NC 組予等量枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。成模后第2天開(kāi)始，CT組給予鹽酸貝那普利 10 mg·kg－1·d－1和纈沙坦 10 mg·kg－1·d－1混懸液灌胃，NC、DN組給予等量0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均自由飲水及進(jìn)食，不給予胰島素及其他任何降糖藥物，8周后處死。

1.4 標(biāo)本收集及指標(biāo)測(cè)定 觀察指標(biāo):于實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第8周測(cè)定并記錄各組大鼠體重。腎臟病理:第8周末麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血處死大鼠后留取部分右腎組織采用10%中性甲醛固定，行免疫組織化學(xué)染色，同時(shí)將部分腎皮質(zhì)切成1 mm的立方小塊，2.5%戊二醛固定，用來(lái)制作超薄切片，并在鉛鈾雙染色后在日產(chǎn)JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟病理變化;免疫組織化學(xué)檢測(cè):所有待檢測(cè)標(biāo)本以10%甲醛固定，石蠟包埋，制成厚4 μm的切片，采用Elivision法檢測(cè)腎組織中nephrin的表達(dá)。切片脫蠟后加3%H2O2去離子水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，液微波修復(fù)，3%過(guò)氧化氫孵育，滴加兔抗大鼠nephrin抗體(博奧森試劑公司)，4℃過(guò)夜，依次滴加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)和酶標(biāo)抗兔聚合物(試劑B)，滴加DAB顯色劑(以上試劑均屬福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)，鏡下控制顯色時(shí)間，之后蘇木精輕度復(fù)染細(xì)胞核，藍(lán)化、脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。nephrin表達(dá)采用半定量分析，即隨機(jī)選取10個(gè)連續(xù)不重復(fù)的視野(×200)，根據(jù)腎小球足細(xì)胞著色情況計(jì)算陽(yáng)性指數(shù)(PI):陽(yáng)性信號(hào)面積×陽(yáng)性強(qiáng)度，求和、取平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠nephrin表達(dá)陽(yáng)性指數(shù)情況 與NC組(5.9±0.7)比較，DN 組(2.1 ±0.3)nephrin表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.40，P＜0.01);CT 組(5.0 ±0.7)表達(dá)輕度下調(diào)，下調(diào)程度低于NC組正常值(t=2.53，P＜0.05)，但明顯高于 DN 組(t=10.60，P＜0.01)。

2.2 免疫組化情況 NC組大鼠腎小球基底膜上，可見(jiàn)nephrin正常線性分布，nephrin蛋白特異性的表達(dá)在腎小球基底膜足突細(xì)胞上，腎小管中也有少量表達(dá);DN組大鼠腎小球基底膜nephrin呈顆粒狀分布，顏色變淺;CT組腎小球基底膜nephrin呈斑點(diǎn)/線狀分布。見(jiàn)圖1。

2.3 電鏡情況 NC組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，基底膜均勻一致，基本無(wú)足突細(xì)胞融合。DM組腎小球毛細(xì)血管基底膜厚薄不均，總體呈明顯增厚，結(jié)構(gòu)模糊不清，足突破壞、融合、部分脫落，系膜基質(zhì)增多、腫脹，系膜區(qū)基質(zhì)增生，可見(jiàn)少量電子致密物質(zhì)沉積。CT組基底膜基本均勻，無(wú)明顯增厚，足突細(xì)胞寬度變小、足突融合率降低。足突細(xì)胞數(shù)基本恢復(fù)正常，僅有少量足突細(xì)胞融合，系膜區(qū)基質(zhì)輕度增生。見(jiàn)圖2。

圖1 3組大鼠nephrin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(Elivision×200)

圖2 3組大鼠腎足細(xì)胞電鏡結(jié)果(鈾鉛染色×6 000)

3 討論

DN的發(fā)生主要與腎小球的濾過(guò)障礙相關(guān)，位于腎小球基底膜(GBM)外側(cè)的足細(xì)胞的足突相互交替形成裂孔構(gòu)成足突間裂孔隔膜，是蛋白質(zhì)丟失的最后屏障。足細(xì)胞nephrin蛋白是一種由1 241個(gè)氨基酸組成的跨膜糖蛋白，屬于細(xì)胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族成員，是裂孔隔膜上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)跨膜蛋白，由足細(xì)胞表達(dá)、構(gòu)成裂孔隔膜拉鏈樣結(jié)構(gòu)，與podocin、CD2AP組成復(fù)合體，維持裂孔隔膜結(jié)構(gòu)的完整，阻止蛋白濾出。nephrin作為足細(xì)胞裂隙膜的關(guān)鍵組成成分，對(duì)高度特異性的足細(xì)胞功能起到關(guān)鍵作用，能通過(guò)介導(dǎo)上皮細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用影響GBM的通透性和基質(zhì)的沉積，影響腎臟濾過(guò)膜結(jié)構(gòu)與屏障功能完整性。本研究發(fā)現(xiàn)，DN動(dòng)物模型觀察8周后nephrin表達(dá)明顯下調(diào)，形態(tài)學(xué)顯示呈顆粒狀減少，同時(shí)電鏡示基底膜足細(xì)胞受損，而CT組經(jīng)纈沙坦與貝那普利聯(lián)合干預(yù)8周后nephrin表達(dá)上調(diào)，免疫組化顯示nephrin呈斑點(diǎn)/線狀恢復(fù)過(guò)程，電鏡示基底膜足細(xì)胞大致恢復(fù)正常。這一結(jié)果與纈沙坦和貝那普利各自作用機(jī)制及DN發(fā)病過(guò)程中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin.angiotensin system，RAS)過(guò)度激活相關(guān)［10］，作為 RAS重要成員的血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，ANGⅡ)、血管緊張素Ⅱ受體(angiotensinⅡ type receptor，ATR)在RAS中最具生物活性，ANGⅡ通過(guò)對(duì)足細(xì)胞裂孔膜上具有重要生理功能的蛋白nephrin表達(dá)的調(diào)節(jié)導(dǎo)致足細(xì)胞受損，增加尿蛋白排泄;RT-PCR技術(shù)證明分化的人腎臟足細(xì)胞上有大量ATR1表達(dá)［11］;貝那普利為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)，阻止血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ，從而減低由血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的一切作用;纈沙坦是一種特異性的血管緊張素Ⅱ(AT1)受體拮抗劑，它選擇性地作用于AT1受體亞型，阻斷ANGⅡ與AT1受體的結(jié)合。眾多研究對(duì)兩種藥物對(duì)DN的療效已有確切報(bào)道［12，13］，但對(duì)兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DN的干預(yù)報(bào)道少見(jiàn)，本研究在RAS對(duì)nephrin表達(dá)影響致DN發(fā)病機(jī)制基礎(chǔ)上，利用纈沙坦與貝那普利不同的藥理特點(diǎn)對(duì)DN大鼠模型進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)，成功調(diào)節(jié)了nephrin的表達(dá)，恢復(fù)腎小球足細(xì)胞功能形態(tài)，從而更有效的改善DN癥狀，延緩DN進(jìn)展。

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