羅興燕，張 梅，劉 進(jìn)綜述，舒 茂△審校（.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院 400054；.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司 400600）

有絲分裂雙極紡錘體是癌癥化學(xué)療法中一個(gè)已證實(shí)的藥物靶點(diǎn)，如紫杉烷和長(zhǎng)春堿等作用于微管抑制紡錘體形成，在臨床上是一類很成功的抗腫瘤藥物。但微管在細(xì)胞的高爾基體、突觸小泡等細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用，對(duì)軸突微管也有抑制影響。因此，作用于微管的抗增殖藥物具有不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)毒性，長(zhǎng)期使用這類藥物會(huì)使腫瘤產(chǎn)生抗藥性［1］。尋找有絲分裂紡錘體的其他靶點(diǎn)是目前開發(fā)新的抗腫瘤藥物的重要途徑。紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白家族是紡錘體形成的重要蛋白，已成為近年來靶向抗癌化學(xué)療法的新靶點(diǎn)［2］。驅(qū)動(dòng)蛋白在有絲分裂的紡錘體形成、細(xì)胞分裂和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。驅(qū)動(dòng)蛋白家族有650個(gè)成員，被分為14類亞家族，主要有細(xì)胞分離和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)兩大類主要功能。Eg5是紡錘體形成中的重要蛋白，在不發(fā)生細(xì)胞分裂的細(xì)胞中沒有表達(dá)。因此，Eg5抑制劑在神經(jīng)細(xì)胞中沒有毒性作用，不具有抗微管藥物的作用［3］。近年來已經(jīng)成為抗癌藥物的研究熱點(diǎn)，本文就Eg5參與腫瘤的機(jī)制及其抑制劑研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 Eg5結(jié)構(gòu)和功能

Eg5也稱KIF11，是驅(qū)動(dòng)蛋白家族5中BimC的同源四聚物，屬于N型驅(qū)動(dòng)蛋白。Eg5共有1 057個(gè)氨基酸殘基，主要有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的啟動(dòng)區(qū)、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的莖干區(qū)和C端尾巴區(qū)。啟動(dòng)區(qū)前有20個(gè)氨基酸殘基，開始于β1折疊結(jié)構(gòu)的Val21，終止于 RAK 模序 R6結(jié)構(gòu)上的 Lys357。Asn358－Pro363是連接啟動(dòng)區(qū)和中間卷曲結(jié)構(gòu)（Glu364－Val523，Cys684－Lys716，Gln782－Arg826）的連接子（linker）。Eg5的 C末端區(qū)域（Tyr829－Leu1057）包含一個(gè)p34cd2磷酸化位點(diǎn)，在體內(nèi)Thr927是p34cd2蛋白激酶一個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)［4］。Eg5的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β片層和α螺旋結(jié)構(gòu)組成［5］。

Eg5四聚體形成兩兩二聚體相互交叉，棒狀末端反向平行在微管上滑動(dòng)產(chǎn)生外向的力。N－末端驅(qū)動(dòng)蛋白沿著微管（MTs）滑動(dòng)，主要功能是在中心體分離組裝形成雙極紡錘體時(shí)，提供一個(gè)正向牽力，并防止雙極性紡錘體在染色體分離后期之前崩解［6］。因此，Eg5常被人熟知的功能就是形成紡錘體，參與有絲分裂。研究者通過RNAi干擾技術(shù)、Eg5抗體中和及小分子抑制劑抑制Eg5均可以阻滯腫瘤細(xì)胞在有絲分裂中期，隨后導(dǎo)致細(xì)胞死亡［2］。Bartoli等［7］最近研究提出Eg5同時(shí)可以參與多肽的合成，其小分子抑制劑可能會(huì)影響細(xì)胞有絲分裂間期的蛋白合成［8］。但是目前主流的觀點(diǎn)還是集中在Eg5對(duì)細(xì)胞有絲分裂中期的影響，其中最具有意義的就是抑制劑和Eg5作用形成Monoastral紡錘體［9］。Monoastral紡錘體最初是Mayer等學(xué)者在1999年發(fā)現(xiàn)化合物Monastrol與Eg5形成復(fù)合物導(dǎo)致有絲分裂中止，紡錘體中止在有絲分裂中期的特征結(jié)構(gòu)定義。Monastrol是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的Eg5蛋白特異性小分子化合物抑制劑，主要是與Eg5結(jié)合后通過構(gòu)象改變抑制二磷酸腺苷（ADP）從Eg5中的釋放，是一類三磷酸腺苷（ATP）的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑［10］。Kaan等學(xué)者用Eg5與S－三苯甲基－L半胱氨酸（S－trityl－L－cysteine，STLC）結(jié)合的晶體復(fù)合物0.2nm分辨力來研究抑制劑與Eg5結(jié)合方式，抑制劑與Eg5結(jié)合后使Eg5構(gòu)象改變，導(dǎo)致ADP不能從Eg5中釋放形成 Monoastral紡錘體［5］。

Eg5與有絲分裂密切相關(guān)，有研究證明了Eg5在腫瘤中表達(dá)失調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。Nowichi等［11］就利用基因芯片分析中發(fā)現(xiàn)Eg5在慢性粒細(xì)胞性白血病中高表達(dá)。南開大學(xué)的生命科學(xué)遺傳細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞中Eg5也高表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞快速增殖［12］。這些研究都為Eg5可以作為一個(gè)潛在的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)提供了依據(jù)，使Eg5的抑制劑開發(fā)成為了近年來的熱門研究。

2 Eg5抑制劑

隨著Monastrol的發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，尋找Eg5新的抑制劑成為許多醫(yī)藥公司和研究者研究開發(fā)抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)，Eg5抑制劑篩選多是基于化合物的高通量篩選和已知化合物的結(jié)構(gòu)改造，結(jié)合多學(xué)科的發(fā)展如計(jì)算機(jī)、生物信息學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)等來完成，抑制劑的種類和數(shù)量不斷地被研究擴(kuò)展。如2004年發(fā)表的STLC化合物，其發(fā)現(xiàn)過程是Debonis從NCI數(shù)據(jù)庫最開始篩選到2 869個(gè)小分子化合物用于測(cè)試他們抑制微管－Eg5中的ATP酶活性，結(jié)果有154個(gè)化合物具有抑制Eg5的ATP酶活性，154中有15個(gè)化合物的孔雀綠測(cè)試中抑制結(jié)果為陽性，其中，5個(gè)化合物抑制HeLa細(xì)胞，使有絲分裂中止。STLC是其中活性最好，能抑制Eg5能使紡錘體形成Monoastrol紡錘體［13］。STLC發(fā)現(xiàn)后，Debonis又利用計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)軟件和化學(xué)合成對(duì)STLC結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了一系列活性更好的化合物，STLC的抗癌活性在膀胱癌，前列腺癌等體外實(shí)驗(yàn)研究中得到了驗(yàn)證［3，14］。

參與Eg5抑制劑的研究中包含了一些大型的醫(yī)藥公司和研究單位，由于這些科研工作者的不斷努力，近10多年的時(shí)間越來越多的Eg5抑制劑和研究方法被研究報(bào)道，其中，活性好的化合物已 經(jīng)進(jìn)入了臨 床研究［13，15－19］，如Ispinesib、AZD4877化合物已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ／Ⅱ期臨床研究。

2.1 Ispinesib／SB－715992 Ispinesib／SB－715992是屬于嘧啶酮類化合物由GlaxoSmithKline和Cytokinetics公司開發(fā)，Ispinesib的作用機(jī)制與Monastrol抑制方式相同，均通過結(jié)合Eg5形成Monoastral紡錘體，中止細(xì)胞有絲分裂，但比Monastrol具有更好的活性，是第一個(gè)進(jìn)入腫瘤臨床試驗(yàn)的驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5ATP酶的變構(gòu)的小分子抑制劑［20］。在臨床前研究中，Ispinesib抑制人類和小鼠細(xì)胞系的IC50為1.2～9.5μM，在體外用20μM的Ispinesib作用于SKOV3卵巢癌細(xì)胞可導(dǎo)致有絲分裂中止。對(duì)裸鼠移植瘤模型，如結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌，腹腔注射Ispinesib 30mg／kg，均發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)延遲。2003年Glaxo Smith Kline公司進(jìn)入非小細(xì)胞肺癌Ⅱ期臨床研究，至今Ispinesib有16個(gè)項(xiàng)目進(jìn)入了臨床Ⅰ／Ⅱ研究，隨后多個(gè)研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行多種腫瘤的臨床研究，所有的研究中沒有明顯的藥物毒性產(chǎn)生，劑量限制性毒性（DLT）表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞減少，沒有觀察到明顯的神經(jīng)毒性［21－22］。但是在惡性黑色素瘤、頭頸部腫瘤、前列腺癌、肝癌Ⅱ期臨床研究中作用效果不好，可能原因是由于在動(dòng)物移植瘤中瘤細(xì)胞分裂占大部分而人腫瘤分裂相對(duì)少，藥物的半衰期短，作用于靶點(diǎn)位置的時(shí)間不夠，造成在人的腫瘤中效果不佳［23］。臨床研究中的14個(gè)項(xiàng)目已經(jīng)完成，其中，2個(gè)還在繼續(xù)研究。

2.2 AZD4877 AZD4877由Astra Zeneca研究開發(fā)，也屬于嘧啶酮類化合物。AZD4877是從一系列新穎的驅(qū)動(dòng)蛋白紡錘體蛋白（KSP）抑制劑篩選出的抑制Eg5活性的化合物，兼具優(yōu)異的生化性質(zhì)和藥物特性的適合于臨床開發(fā)的Eg5－ATP酶的變構(gòu)的小分子抑制劑［24］。AZD4877研究對(duì)很多來源于實(shí)體瘤和血液瘤的細(xì)胞株都有抑制作用［16］。裸鼠移植瘤模型的原發(fā)性膀胱腫瘤模型、利妥昔單抗不敏感非霍奇金淋巴瘤模型（DoHH2T53）中，在 AZD4877劑量的耐受范圍，25mg／kg可以檢測(cè)到Monoastral紡錘體，這些均為AZD4877臨床研究提供了依據(jù)。AZD4877在西方和日本實(shí)體瘤患者的Ⅰ期臨床研究都有很好的耐受性和安全性，但是并沒有觀察到高的抗癌活性［17］。目前進(jìn)入臨床的6個(gè)項(xiàng)目都因?yàn)锳ZD4877在Ⅱ期臨床研究中沒有作用而中止研究［16－17，25］。

2.3 SB－743921／ARRY－520 嘧 啶酮 類 化 合物Ispinesib和AZD4877在多種腫瘤Ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示效果不好，抗腫瘤活性不高。第二代嘧啶酮類化合物SB－743921與前2種化合物相比，它的臨床前研究結(jié)果顯示活性更好，在Holen報(bào)道的SB－743921的藥代動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)得到令人滿意結(jié)果，推薦Ⅱ期臨床研究的劑量為4mg／m2，每天靜脈滴注1h并持續(xù)21d。以Ispinesib結(jié)構(gòu)改造的Eg5抑制劑還有ARRY－520等多個(gè)嘧啶酮類化合物衍生物，也進(jìn)入了臨床研究，目前，還沒有臨床數(shù)據(jù)報(bào)道，他們的活性比Ispinesib更高［26］。

2.4 MK－0731 二氫吡唑類、二氫吡咯類化合物是 Merck公司研究實(shí)驗(yàn)進(jìn)行高通量篩選和結(jié)構(gòu)改造合成的一批具有良好活性的Eg5抑制性的化合物，其作用機(jī)制與Monostral一樣，與Eg5結(jié)合后通過構(gòu)象改變抑制ADP從Eg5中的釋放，也屬于一類ATP的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑［27］。其中，化合物 MK－0731是優(yōu)化改造后具有良好的化學(xué)特性和生物特性，在體內(nèi)外表現(xiàn)出低毒性和好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)?；衔锬芤种茖?duì)紫杉醇藥物依賴的腫瘤生長(zhǎng)。臨床前實(shí)驗(yàn)研究表現(xiàn)出良好的最大劑量耐受，不良反應(yīng)小，安全性好，MK－0731在實(shí)體瘤的Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到明顯的腫瘤減?。?8］。

雖然Eg5抑制劑在臨床前研究結(jié)果取得好的進(jìn)展，但是在臨床中的研究的結(jié)果大多數(shù)都是不盡人意，進(jìn)入人體的安全性好但是基本也沒有活性。通過上面幾種化合物的分析研究，臨床前期在動(dòng)物模型有藥物作用，但在臨床研究中患者的體內(nèi)沒有作用，可能原因在動(dòng)物模型中進(jìn)行有絲分裂的腫瘤細(xì)胞的比例比腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞比例高，抑制劑作用患者時(shí)間不足以造成腫瘤細(xì)胞有絲分裂中止，抑制劑作用的腫瘤細(xì)胞株不敏感等，造成在動(dòng)物模型中的效果好。這也需要研究者的繼續(xù)研究來突破這些缺點(diǎn)。

3 Eg5研究趨勢(shì)

Monastrol是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Eg5驅(qū)動(dòng)蛋白抑制劑，與Eg5結(jié)合形成Monoastral紡錘體后使有絲分裂中止造成細(xì)胞凋亡后死亡。Eg5在穩(wěn)定的細(xì)胞中不表達(dá)，不對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成毒性，克服了目前抗微管腫瘤藥物造成的不良反應(yīng)和耐藥性。因此，Eg5成為了熱門研究靶點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外大型醫(yī)藥公司和頂尖實(shí)驗(yàn)室都努力尋找最優(yōu)的Eg5抑制劑并希望開發(fā)新一代抗癌藥物，用以克服現(xiàn)在抗微管藥物出現(xiàn)的不良反應(yīng)，其中，一些化合物已進(jìn)入了臨床試驗(yàn)抗癌研究階段。至今有30多種化合物進(jìn)入了臨床研究，但是沒有一種化合物成為藥物上市。這些化合物雖然不良反應(yīng)小，但因在體內(nèi)抗癌藥物活性不高而沒有繼續(xù)被研究。Eg5抑制劑開發(fā)面臨著幾個(gè)問題：Eg5抑制劑對(duì)什么類型腫瘤敏感？在體內(nèi)如何提高藥物和腫瘤作用時(shí)間來中止有絲分裂？目前研究顯示，Eg5抑制劑單一療法效果不佳，聯(lián)合用藥雖然有研究報(bào)道，但沒有發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用。

Eg5是一個(gè)很吸引人的藥物靶點(diǎn)，但其藥物抑制劑要用于抗癌藥物治療仍需要研究人員的不懈努力。現(xiàn)階段亟待解決的主要問題是：Eg5的研究應(yīng)走向何方；如何開發(fā)新的篩選方法尋找新的Eg5抑制劑；如何建立高通量篩選方法為抑制劑快速找到敏感的腫瘤株；如何同現(xiàn)有的腫瘤抑制劑聯(lián)合用藥，以發(fā)揮不同的藥物作用以及改變藥物的劑型以提高在體內(nèi)的時(shí)間，在Eg5中尋找到新的抑制方式，發(fā)現(xiàn)新的抑制劑。還有，Eg5屬于驅(qū)動(dòng)蛋白的一個(gè)大家族，找尋其他的驅(qū)動(dòng)蛋白靶標(biāo)也成為現(xiàn)在抗腫瘤藥物發(fā)展的新方向。

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