戚琛曄,馬靈筠,席守民

氧化應(yīng)激是指活性分子，例如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)以及活性氮簇(reactive nitrogen species, RNS)等的過度生成，從而造成體內(nèi)活性氧類生成與抗氧化防御功能之間平衡的紊亂。2001年Brownlee提出2型糖尿病及其血管并發(fā)癥有共同的發(fā)病機制——氧化應(yīng)激，作為糖尿病及其慢性并發(fā)癥的罪魁禍?zhǔn)?，貫穿于整個發(fā)病過程中。2 型糖尿病是一種復(fù)雜的多因素疾病，其發(fā)病與許多環(huán)境因素，包括老齡、高熱量食物攝入過度、運動量減少、肥胖等有關(guān)。近年來各方面的研究顯示，氧化應(yīng)激是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。本文就氧化應(yīng)激對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)的影響作用進(jìn)行闡述。

1 GLUT4概述

GLUT4是一種分子量為45～55 kD，含509個氨基酸單一多肽鏈的糖蛋白，基本結(jié)構(gòu)是由12個跨膜片段組成含有2個較大的環(huán)形結(jié)構(gòu)，其中一個定位于第1、第2跨膜節(jié)段的細(xì)胞外區(qū)域，另一個定位于第6、第7跨膜節(jié)段的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，其氨基末端及羧基末端均位于細(xì)胞膜的胞漿面。1980年就有報道說，大鼠脂肪細(xì)胞胰島素可以觸發(fā)糖轉(zhuǎn)運體從細(xì)胞內(nèi)貯存到細(xì)胞質(zhì)膜的易位。這種易位假說后來被證實。確定GLUT4是這些細(xì)胞中的主要葡糖轉(zhuǎn)運體。GLUT4是脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞協(xié)助葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要蛋白質(zhì)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，90%位于細(xì)胞內(nèi)的一些特定囊泡樣結(jié)構(gòu)中，這些結(jié)構(gòu)被稱作GLUT4儲存囊泡(GLUT4 storage vesicles，GSVs)。在胰島素信號或運動等的刺激下，通過激發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)的GLUT4易位到細(xì)胞外膜上，促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運，從而使血糖降低。在胰島素含量下降時，細(xì)胞通過內(nèi)吞作用將GLUT4運回細(xì)胞內(nèi)，貯存于囊泡中，恢復(fù)靜息狀態(tài)。在運動或進(jìn)食后，GLUT4轉(zhuǎn)運葡萄糖的效率可以比平時提高10～40倍，以滿足肌肉運動時向骨骼肌細(xì)胞快速提供能量，或餐后快速把血液中的糖轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)[1]。許多觀察表明，GLUT4在全身葡萄糖體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用。

2 GLUT4相關(guān)信號通路

2.1PI3K/Akt途徑在胰島素信號通路中，胰島素結(jié)合其受體使胰島素受體底物(IRS)的多個酪氨酸殘基磷酸化，從而引起磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活化。活化的PI3K產(chǎn)生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)，PDK1激活蛋白激酶B(PKB，又稱Akt)。Akt可通過提高胰島素表達(dá)、提高胰島素受體活性、強化GLUT4對胰島素的反應(yīng)性、提高Akt底物蛋白160(ASl60)的表達(dá)和活性與GLUT 4構(gòu)成嵌合體等機制促進(jìn)GLUT4蛋白易位[2]。PI3K/Akt是調(diào)控胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位的主要信號通路。近年來通過采用基因敲除等技術(shù)，揭示PI3K的催化亞基p85以及調(diào)節(jié)亞基p110對于調(diào)控葡萄糖代謝中的重要作用。p85調(diào)節(jié)亞基有p85α～p85β，p55γ～p55α和p50α 5種亞基，在GLUT4囊泡中只含有p85α亞基。p85α一方面通過與催化亞基 p110 結(jié)合抑制P110的活性，從而介導(dǎo)胰島素或其他生長因子的信號傳導(dǎo)，另一方面游離的p85對胰島素信號通路起負(fù)調(diào)控作用。因此，p85和p110的比例對胰島素敏感性起著重要的調(diào)控作用。當(dāng)有胰島素刺激時，IRS上酪氨酸磷酸化，促使p85α解除對P110的抑制作用，P110催化膜磷脂生成PIP3，激活A(yù)kt或非典型性蛋白激酶C(aPKC)，促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)位。糖原合酶激酶-3(GSK-3)是受Akt調(diào)控的重要下游分子，并且對IRS-1的活性具有抑制作用。Lochhead 等[3]研究證實，GSK-3抑制劑可以促進(jìn)大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的GLUT4向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，提高骨骼肌中胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運。這提示GSK-3是PI3K/Akt信號通路調(diào)控GLUT4的下游信號分子之一。

2.2CAP/Cbl途徑CAP/Cbl途徑是胰島素信號通路中的一個分支，由胰島素受體、原癌基因蛋白Cbl及CAP銜接蛋白等組成，是參與葡萄糖轉(zhuǎn)運的信號途徑。其中CAP是原癌基因Cbl的相關(guān)蛋白，其羧基端含有3個相毗鄰的SH3區(qū)段，Cbl通過與其中一個SH3結(jié)構(gòu)域相互作用形成CAP/Cbl異源二聚體，并通過CAP與胰島素受體相連，促使Cbl的酪氨酸磷酸化?；罨蟮腃bl與小結(jié)合蛋白(Crk)和富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的鳥苷交換因子(C3G)相互作用，形成CAP-Cbl-Crk-C3G的復(fù)合物。此復(fù)合體特異地與一種稱為脂筏(lipid rafts)的亞結(jié)構(gòu)域發(fā)生作用，在不依賴PI3K信號通路的情況下，從而特異性地促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)位。穆穎等[4]研究證實，GLUT4作為骨骼肌細(xì)胞的攝取葡萄糖的限速蛋白受Cbl、TC10的信號偶聯(lián)作用調(diào)控，而且存在時間劑量依賴關(guān)系；用β-CD封閉細(xì)胞膜上的脂筏后，cbl、TC10的信號通路也會受到抑制，GLUT4 mRNA表達(dá)豐度下降。這說明CAP/Cbl/TC10途徑也可以獨立地刺激誘導(dǎo)GLUT4蛋白的轉(zhuǎn)位。

2.3AMPK激活途徑AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細(xì)胞內(nèi)重要的能量代謝感受器，屬于代謝敏感性蛋白激酶家族，是調(diào)節(jié)多種代謝過程的重要信號分子。運動可以刺激骨骼肌AMPK活性的升高，并通過增加其下游級聯(lián)激活信號引起GLUT4囊泡GSVs向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位。運動時，肌肉的收縮會導(dǎo)致骨骼肌中ATP減少、AMP增加，從而激活A(yù)MPK。在安靜狀態(tài)下，骨骼肌中AMPK可以被AICAR激活，促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運。AICAR，全稱為5-Aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside，也稱AICA Riboside或Acadesine，是一種可通透細(xì)胞膜AMPK的激活劑。眾多研究發(fā)現(xiàn)，AICAR可以引起GLUT4表達(dá)水平的明顯增加，同時胰島素刺激后葡萄糖攝入也明顯增加[5-6]。這表明AMPK的激活是提高GLUT4表達(dá)的機制之一。有實驗研究表明，通過AICAR使PGC-1α上調(diào)會同時伴隨GLUT4的表達(dá)上調(diào)。這說明AICAR誘導(dǎo)GLUT4表達(dá)可能是由PGC-1介導(dǎo)的。同時，運動誘導(dǎo)的GLUT4的轉(zhuǎn)位也與AMPK有關(guān)[7-8]。然而，近來有關(guān)AMPK在葡萄糖轉(zhuǎn)運中的作用依舊備受爭議。有文獻(xiàn)表明，AICAR和瘦素介導(dǎo)的胰島素抵抗可通過AS160磷酸化和GLUT4轉(zhuǎn)運得以迅速改善，但是不是由AMPK的磷酸化引起的[9]。Viollet 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可能在葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中并不發(fā)揮作用。Lemieux[11]等認(rèn)為，AMPK途徑并不誘導(dǎo)GLUT4的轉(zhuǎn)位，但是能通過刺激p38MAPKα和β誘導(dǎo)骨骼肌中葡萄糖的攝取。

2.4聯(lián)合作用GLUT4表達(dá)與轉(zhuǎn)位的調(diào)節(jié)與多種因素有關(guān)。目前認(rèn)為，運動和胰島素濃度是調(diào)節(jié)GLUT4的兩個最重要因素。運動和胰島素都可以通過激活PI3K和MARK途徑刺激GLUT4的表達(dá)，其中胰島素對于兩條途徑的激活作用要強于運動；同時運動與胰島素對這兩條途徑的激活作用存在疊加效應(yīng)。Chen[12]等發(fā)現(xiàn)運動可能是同時激活了aPKC和AMPK信號通路使GLUT4蛋白的表達(dá)增加。在GLUT4轉(zhuǎn)位的調(diào)節(jié)上，胰島素刺激GLUT4的轉(zhuǎn)位主要是通過胰島素信號途徑中的PI3K途徑和CAP/Cbl途徑，而運動誘導(dǎo)的GLUT4的轉(zhuǎn)位主要是通過AMPK、MAPK等信號實現(xiàn)的。林強[13]等人研究顯示，電刺激誘導(dǎo)的骨骼肌收縮可促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)位，這一過程中AMPK和PI3K都參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，只抑制其中一條信號通路不能阻止GLUT4的轉(zhuǎn)位。也有研究表明，血管緊張素Ⅱ(angiotensin II, Ang II)抑制胰島素介導(dǎo)的GLUT4易位時至少經(jīng)過了兩個途徑：一是通過抑制IRS-1/2瞬間激活ERK1/2，二是直接抑制Akt硝化。

3 氧化應(yīng)激對GLUT4的表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)高活性分子，主要指活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)產(chǎn)生過多，與抗氧化防御系統(tǒng)作用失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。ROS主要包括不帶電粒子如超氧陰離子自由基和羥自由基，以及帶電粒子如過氧化氫。ROS激活許多氧化應(yīng)激有關(guān)的信號通路，作用類似于第2信使信號分子：①絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen．a(chǎn)ctivated protein kinases，MAPK)信號傳導(dǎo)途徑；②P13K/Akt途徑；③磷脂酶C和蛋白激酶C(PKC)；④核因子(NF-κB)和共濟失調(diào)—毛細(xì)血管擴張癥突變(ATM)激酶；⑤其他的信號傳導(dǎo)分子和途徑：JAK/STAT途徑、C-Abl酪氨酸激酶、P66shc適配蛋白和熱休克蛋白的表達(dá)。

GLUT4的表達(dá)受多種因素的調(diào)控，其中包括胰島素濃度、運動、高脂高糖飲食等。目前認(rèn)為，線粒體ROS的產(chǎn)生會加重骨骼肌胰島素抵抗，可能使胰島素信號通路受阻，GLUT4的表達(dá)降低，導(dǎo)致胰島素抵抗。研究表明，2型糖尿病大鼠骨骼肌中存在明顯的氧化應(yīng)激損害，并伴隨著胰島素抵抗的明顯增加，結(jié)果顯示與GLUT4的表達(dá)降低有關(guān)。氧化應(yīng)激可引起3T3-L1脂肪細(xì)胞中GLUT4表達(dá)下降，從而導(dǎo)致胰島素抵抗。Pessler等將3T3-L1脂肪細(xì)胞暴露于低微摩爾濃度的H2O2中, 4 h后GLUT4 mRNA 表達(dá)減少, 從氧化細(xì)胞核蛋白提取物中分析顯示結(jié)合GLUT4啟動子的胰島素反應(yīng)元件減少, 表明氧化應(yīng)激通過減弱核蛋白與GLUT4的啟動子的胰島素反應(yīng)元件結(jié)合, 減少了GLUT4的表達(dá)，使用還原劑可以部分恢復(fù)其結(jié)合力[14]。

4 氧化應(yīng)激對GLUT4的轉(zhuǎn)位的影響

有證據(jù)表明，Akt蛋白對ROS極為敏感，使PKB/Akt活性受ROS調(diào)節(jié)，自由基可以破壞其磷酸化位點影響其活化表達(dá)，而復(fù)合抗氧化劑干預(yù)既可通過全面改善機體抗氧化能力，又可以直接保護(hù)PKB/Akt免于氧化損傷，使p-Akt/Akt的表達(dá)較正常對照組顯著增加，激活下游GLUT4從細(xì)胞內(nèi)向膜的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)肌肉和脂肪組織對葡萄糖的攝取。人類肥胖相關(guān)新基因LYRM1的過表達(dá)會通過抑制PI3K與Akt的磷酸化導(dǎo)致GLUT4轉(zhuǎn)位損傷，抑制葡萄糖的攝取，引起胰島素抵抗[15]。α-硫辛酸(α-Lipoic acid，α-LA)是一種常見的超強抗氧化劑，可以提高細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力。在過表達(dá)LYRM1基因的3T3-L1脂肪細(xì)胞中，α-硫辛酸的預(yù)處理顯著增加了胰島素誘導(dǎo)的GLUT4易位和葡萄糖的攝取，同時ROS水平有明顯的下降[16]。這提示氧化應(yīng)激可能是通過抑制PI3K/Akt途徑引起GLUT4的轉(zhuǎn)位下調(diào)。Shibata[17]等人研究發(fā)現(xiàn)百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激抑制PI3K上P110的活性，從而削弱了3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取。這一結(jié)果顯示，PI3K上P110亞基很可能是氧化應(yīng)激抑制PI3K活性以及GLUT4轉(zhuǎn)位的主要靶點。

氧化應(yīng)激引起胰島素抵抗是一個較復(fù)雜的多途徑的過程，其主要環(huán)節(jié)是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS，通過增強絲/蘇氨酸蛋白激酶等信號分子的活性，干擾GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖運輸。然而，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)引起的胰島素抵抗究竟是由于GLUT4的轉(zhuǎn)位障礙還是GLUT4的表達(dá)不足尚不清楚。Garvey[18]等人研究發(fā)現(xiàn)只要存在胰島素抵抗，GLUT4的量也無減少，而轉(zhuǎn)位作用卻發(fā)生了障礙。因此，GLUT4與氧化應(yīng)激之間相關(guān)性的研究對于闡明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)引起胰島素抵抗的機制具有重要意義。

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