王 晶，吳燕燕 ，楊賢慶

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)部水產品加工重點實驗室，廣東廣州510300;2.上海海洋大學食品學院，上海201306)

生物活性肽屬于小分子物質，具有可以被腸道直接吸收的營養(yǎng)特性，其天然活性、安全性以及高效性一直備受關注。早在2000多年前，我國就有《歷代本草》記載了海洋貝類的藥用價值。貝類作為我國近海的主要養(yǎng)殖物種，其年產量占我國總養(yǎng)殖量的80%，是一個豐富的天然活性肽資源庫。與在市面上用于食品、藥品、化妝品以及飼料工業(yè)的合成添加劑相比，從貝類中制備的活性肽安全性和效用都很高，因此成為了當前國內外的熱門研究課題。

1 貝類活性肽的制備

生物活性肽，是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物，又稱功能肽。目前研究的海洋貝類活性肽主要有ACE抑制肽、抗菌肽、抗氧化肽、抗腫瘤肽和神經肽等等，關于其制備和功能活性也有許多研究及應用的報道。由于天然貝類活性肽的含量較低，難以實現大批量生產。所以后續(xù)發(fā)展了水解貝類蛋白來提取功能活性肽的方法，有酸水解、發(fā)酵法和酶水解。酸解制備會影響肽的氨基酸組成和二級結構從而破壞其活性，且過程難以控制;發(fā)酵法多適用于植物來源的多肽制備，并需要配合活性多肽的化學合成和基因工程修飾等技術;而酶法制備活性肽不但生產成本低、產品安全性高，并且水解進程易于控制，是目前制備活性多肽的主要方法。目前國內外對于貝類活性肽的酶解研究主要集中在扇貝、貽貝、牡蠣和文蛤等近海貝類中。對貝類酶解蛋白的加工報道也是隨著生物工程技術的發(fā)展而逐漸增多，由單一的單酶解工藝上升為雙酶復合酶解和多酶分步定向酶解得變革，相應的也從貝類蛋白中提取出了不同功能的活性肽液。吳燕燕等［1-3］對合浦珠母貝抗氧化肽的酶解制備、分離純化以及其抗氧化活性進行了系統(tǒng)研究，采用Sephadex G-25分子篩層析法分離得到相對分子量分別為1437.5、833.7、421.9、244.7、89.0、17.4u 六種活性組分，并驗證了其抗氧化能力，通過細胞溶血實驗、對保濕活性的研究和添加到化妝品中的抗氧化效果驗證了貝類抗氧化肽在化妝品領域中具有廣闊的應用前景。單一酶水解作用是有限的，有時需要兩種酶解復合酶解起到互補的作用切斷相對應的特異性肽鍵，從而提高水解率。張澤等［4］使用單因素實驗設計正交優(yōu)化中性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶酶解長牡蠣，并實驗酶解產物的還原能力和DPPH自由基清除能力。林孌等［5］通過Q檢驗法研究了中性蛋白酶和胰蛋白酶的復合比例，再通過正交試驗確定以風味蛋白酶二段酶解的最佳工藝參數，從而實現文蛤肉復合酶分布酶解工藝。

2 貝類活性肽的分離純化

采用酶法水解蛋白質，得到活性肽液。為了進一步制備高純度的目標活性肽，可以根據各自的特性選擇合理的分離純化方法，能使分子量大小達到1000u以下。

2.1 膜分離技術

膜分離技術是在壓力差和濃度差等推動下的透過性膜，以截留相對分子量為指標，借助于膜的孔徑大小來篩選肽分子，從而實現肽的分離和純化。膜分離根據截留的分子量大小可分為微濾(MF)、超濾(UF)、納濾(NF)和反滲透(RO)。張艷萍等［6］比較了不同截留分子量的超濾膜對紫貽貝酶解物分離所得產物的ACE抑制活性，最后確定了截留分子質量為10ku的超濾膜能將紫貽貝酶解物的ACE抑制率提高到89.42%;黃海等［7］用多種酶對扇貝邊進行深度水解后，采用超濾技術除去未水解的蛋白質、細菌和微細顆粒等成分，成功富集了氨基酸和小分子肽。

超濾技術的操作條件溫和，活性肽受到溫度和pH等因素的影響較小，且處理量大，能避免加入其它溶劑污染分離物。但是超濾膜容易發(fā)生不可逆的污堵問題，且不易清洗，需要依具體情況選擇反洗或化學清洗處理，長此以往還會造成膜斷絲和閥門的損壞。

2.2 色譜法

目前常用于貝類活性肽純化的方法包括凝膠過濾法(GFC)、離子交換層析法(IEC)、高效毛細管電泳法(HPCE)和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)等色譜技術。其中凝膠過濾色譜具有實驗條件溫和以及填料可反復使用的特點，被廣泛用于分離純化水溶性大分子的物質，現較多地聯合幾種色譜方法使用，取長補短達到更好的純化效果。楊永芳等［8］采用反相高效液相色譜驗證了對貽貝水解物進行超濾、DEAE-sepharose離子交換和Sephadex G-25凝膠層析得到的一個抗腫瘤活性肽段的氨基酸序列為Asp-Leu-Tyr;Jiapei Wang 等［9］用 Sephadex LH-20 凝膠過濾色譜分離純化得到一種ACE抑制肽，反相高效液相色譜法測定序列為Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，并利用小鼠體外實驗得出該肽的半抑制濃度為66μmol/L。

2.3 聯用技術

酶解制備的活性多肽并不完全是活性最強的活性肽段的溶液，各肽段間大多具有相似性，所以使用單一的分離純化方法的效果不夠理想。通常需要多種方法聯用，一般多用膜技術結合幾種色譜技術，隨著對活性肽的分離純化、作用機理以及生理效果研究不斷深入，對其純度和結構研究的要求也相應提高，應要求近些年出現了色質聯用，如HPLC串聯質譜和電泳與質譜聯用。趙聽友等［10］將凝膠色譜與高效液相色譜法結合從南海桶形芋螺的毒液中純化出一種新的毒素BtIIIB，聯合氨基酸組成分析、質譜分析和 Edman降解測定 BtIIIB的氨基酸序列為:CCELPCHGCVPCCWP，并用還原法衍生裂解，在MALDI-TOF MS中確定了其二硫鍵的配對方。Pedro等［11］先用HPLC-MS分離分析多肽混合物，再利用CE技術做進一步的分離純化實現了多種肽段的分離。

3 貝類活性肽的構效研究

活性肽蘊藏于貝肉蛋白鏈的功能區(qū)內，在母體蛋白鏈中并不表現其活性，經過水解后才能暴露相關的活性位點。目前對于活性肽的生物活性與其結構之間的關系還不夠明確，因此其相關性研究一直是國內外關注的熱點。雖然此類的報道不多，但可發(fā)現某些肽的活性和結構有一定的普遍性規(guī)律，其功能活性與氨基酸的種類及序列密切相關，現對于活性肽構效研究多圍繞肽的一級結構、氨基酸組成比例以及肽的構象分析。

3.1 貝類活性肽的分子量與活性的關系

國內外研究報道了一些來自貝類蛋白的功能活性肽的分子量，發(fā)現較強活性的功能肽集中在3000u以下。汪秋寬等［12］檢測中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牡蠣的活性肽抗氧化性時，發(fā)現兩種酶分別作用得到的最強羥自由基清除力的抗氧化肽分子量為1074、735u 以及 1191 和 826u。閻欲曉等［13］利用正交試驗優(yōu)化了三種酶酶解文蛤蛋白的條件，并用Sephadex G-50凝膠柱純化了達最佳清除率的三種酶解物，結果證明水解液中的抗氧化肽分子量集中在1000u以下。

3.2 貝類活性肽的一級結構與活性的關系

活性肽分子表現出各自較強的活性往往與其自身的氨基酸組成和排序相聯系，甚至可以認為一些氨基酸結構的存在決定了肽的功能活性。Won等［14］發(fā)酵藍貝沙司，提取純化其中的抗氧化肽，檢測序列為 Phe-Gly-His-Pro-Lyr。Rajapakse 等［15-16］從烏賊中獲得了兩種富含Gly和Leu的抗氧化肽，且兩種疏水性氨基酸出現頻率也較高，進一步研究發(fā)現在發(fā)酵貽貝沙司中抗氧化肽的活性還與序列中的酸性氨基酸側鏈羧基螯合金屬離子相關。王日昕等［17］分離純化厚殼貽貝血清抗菌肽，經過高效液相和氣質聯用分析抗菌肽的氨基酸序列結構，證實得到的3種抗菌肽N末端與地中海貽貝和紫貽貝抗菌肽具有較高的相似性。

3.3 貝類活性肽的構象與活性的關系

肽的構象包括二級結構、疏水性以及二硫鍵等對功能肽的活性存在直接的影響。楊林等［18］深入探討了兩種新型人工抗菌肽mytilin-derived-peptide-1(MDP-1)和mytilin-derived-peptide-2活性差異的結構基礎，研究結果表明MDP-1和MDP-2均采取了典型的β-發(fā)夾結構，其中疏水氨基酸和堿性氨基酸面積差異是造成兩者活性不同的原因所在。劉娜等［19］對中國南海新型芋螺毒素的化學合成、活性測定及表達條件進行了初步探討，中間環(huán)節(jié)采用兩步氧化折疊及HPLC共洗脫證實所測定的α-芋螺多肽折疊主產物的二硫鍵連接方式為Cys 1-Cys3和Cys2-Cys4。也有學者人工合成貝類抗氧化肽氨基酸序列，通過插入或刪除其中的一些序列結構實驗其活性的變化。

目前對活性肽的構效關系研究還處于探索階段，前期研究出的一些活性肽的結構模型仍無法清楚解釋活性肽的作用機理。就前期研究來看，對ACE抑制肽、抗氧化肽和抗菌肽的結構與活性關系研究較多。ACE抑制肽一般含有10個以下氨基酸殘基，肽鏈 C 端主要為 Tyr、Pro、Trp、Phe 和 Leu，N 端為 Arg、Tyr、Gly、Val、Ala、Ile 和 Leu，且 C 端結構對肽的活性影響較N端強，該結果符合Cheung H S(C端含有芳香族氨基酸)和Cushman D W(N端含有疏水性氨基酸)等的觀點，還有學者發(fā)現肽鏈中催化部位Zn(Ⅱ)和肽鍵的羰基氧之間的距離也影響其抑制活性［20］。目前，國內外對抗氧化機理較明確的肽是肌肽和谷胱甘肽，其余的抗氧化肽結構還沒有確切的定論，總結前人的研究可知，抗氧化肽由二至十幾個氨基酸殘基組成，通過含有的酸性氨基酸或組氨酸的側鏈螯合金屬離子減緩氧化作用，或者因為疏水性氨基酸的組合結構容易結合氧加之以有質子供體提供氫原子阻止自由基鏈式反應，如Tyr和Trp。另外，還會受到抗氧化氨基酸以及氨基酸間短程相互作用的空間構象影響。對比以上兩者，對抗菌肽有進一步的二級結構研究，其分子量也相對較大，抗菌肽C端多含有疏水性氨基酸如Ala、Leu或Trp，N端富含堿性氨基酸如Lys、Arg，從而形成兩親分子，N端的正電荷會和菌膜的負電荷結合，C端進入膜脂質雙分子層。多數抗菌肽的第二位氨基酸殘基為色氨酸或中間富含脯氨酸也會直接影響其抗菌活性;目前發(fā)現的抗菌肽種類中二級結構共有四種構型，β折疊只是穩(wěn)定構象，C端環(huán)狀結構比片層結構對活性的影響較大，而α螺旋對抗菌肽的活性起到至關重要的作用［21］。

4 貝類活性肽開發(fā)過程中存在的問題

較國外的研究狀況，國內對于貝類活性肽的研究與開發(fā)還比較薄弱，雖然近年來對貝類多肽的提取方法和活性的研究也取得了一定的進展，但要更進一步解析其結構與活性的關系以及實現高純度活性肽的生產，還存在以下問題有待解決。

4.1 分離純化技術限制

熱點研究的貝類活性肽分子主要集中在3000u以下，鑒于市場那對目的活性肽的純度和活性要求，現有的純化手段還無法實現單一活性肽的分離富集。另外，含有目的肽的酶解液中存在的鹽分，在一定程度上也會影響肽的活性測定。針對在1000u以下的目的肽段來說，脫鹽一直是一個棘手的問題，這也是目前大多數貝類活性肽的研究只能集中在500u以上肽段的原因［22］。

4.2 定向酶解不穩(wěn)定

根據現有的生物技術和生物工程條件還無法實現對目的活性肽分子的精確酶切;另一方面，得到的目的肽分子的活性容易受到外界條件的影響，保存還需要進一步磷酸化、?；吞腔瘉矸€(wěn)定肽段。

4.3 產生苦味

天然活性多肽苦味的產生是由于酶解過程中產生了一些具有苦味的疏水性氨基酸或其衍生物。目前多采用化學修飾掩蓋苦味和使用端肽酶及吸附樹脂去苦味［23］，但仍無法完全解決苦味的問題。

5 貝類活性多肽的應用前景

5.1 在醫(yī)藥行業(yè)的應用

自古以來，醫(yī)書上就有記載貝類的特殊療效，所以開發(fā)貝類功能活性肽在醫(yī)藥行業(yè)中的應用具有廣闊的前景。目前開發(fā)較成功的當屬牡蠣產品，如“東海三豪”、“牡蠣EXT全營養(yǎng)片”以及“海王金樽”，而其他貝類的藥用研究主要集中在文蛤多肽的抗癌和抗腫瘤活性方面，例如上海市第二人民醫(yī)院已對文蛤中的不同蛋白質成分做了小鼠驗證試驗和臨床驗證，結果表明其提取物在幫助腫瘤患者延長存活時間方面起到一定的作用［24］。國內成功投產的貝類肽藥物有以海洋貝類?；撬釣橹饕煞值牧Χ嗑汪~蛋白等?？寡趸暮虯CE抑制肽具有延緩衰老，防止血管疾病的效用，此類保健品包括具有免疫調節(jié)兼具輔助降血糖功能的“銀蜊膠囊”和具有抗氧化功能的“銀蜊蛋白酶解肽粉”。

5.2 在食品行業(yè)的應用

貝類活性肽營養(yǎng)豐富，且可以改善腸道和調節(jié)機體生理活動，所以作為功能食品開發(fā)有很好的前景。目前酶解貝類蛋白獲得氨基酸種類齊全的功能活性短肽產品，在市面上常見的是扇貝裙邊制品:海之味扇貝裙邊食品、扇貝調味汁，貝類調味品。蔡冰娜等［25］用動物實驗證明了牡蠣肽腸內營養(yǎng)制劑對腸道功能的修復作用，理論證明了它對臨床病人腸道障礙發(fā)揮緩解作用的可行性。在食品保鮮貯藏及加工方面另一具有應用價值的是貝類抗菌肽產品，抗菌肽具有較好的廣譜抗菌性，可作為食品天然防腐保鮮劑。宋宏霞等［26］用貽貝粗抗菌肽對鱸魚進行保鮮研究，結果證明了貽貝粗抗菌肽的抗菌效果與山梨酸鉀以及殼聚糖相當，具有廣闊開發(fā)前景。

5.3 在化妝品行業(yè)的應用

天然抗氧化肽也是化妝品行業(yè)之新寵，大部分海洋活性多肽可以作為細胞生長因子，影響多種類型細胞的生長，對美容護膚、整形外科、燒傷潰瘍以及各種皮膚病的傷口修復與愈合都有極其明顯的效果。孫恢禮等［27-28］人與保健品公司合作，研制了一種含有海洋貝類活性肽的化妝品并公布其制備方法，另外還申請了一項應用海洋貝類活性肽和海洋膠原蛋白肽細致毛孔的化妝品專利。

海洋生物因其生存環(huán)境的特殊性，使得海洋蛋白質與陸地生物蛋白存在很大的差異，酶解釋放的活性多肽具有一定的優(yōu)越性。我國海洋貝類資源豐富，若能加強對海洋酶類的制取研究，就能提高貝類蛋白的酶解率和活性功能肽的制備能力，并實現海洋貝類的高值化利用，從而擴大用于各個工業(yè)領域中，以增強我國貝類活性肽開發(fā)利用的國際競爭力。

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