譚方正，劉新，樸成哲

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)2010級(jí)，遼寧 沈陽 110034;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，3.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨科)

骨髓間充質(zhì)細(xì)胞 (bone marrow stromal cells，BMSCs)是指骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中含有的一類多能干細(xì)胞，它不表達(dá)造血干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志，在不同的誘導(dǎo)條件下，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞分化的能力。BMSCs來源廣泛，可以分化為更多種類的組織細(xì)胞，分離培養(yǎng)較為容易，植入反應(yīng)較弱，易于被外源基因轉(zhuǎn)染且穩(wěn)定表達(dá)。本文就BMSCs的研究進(jìn)展作簡要綜述。

1 BMSCs的生物學(xué)特性

BMSCs具有干細(xì)胞自我修復(fù)、自我更新、高度增殖和多向分化潛能的特性，不同誘導(dǎo)條件可使其向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，被認(rèn)為是一種理想的組織工程種子細(xì)胞。BMSCs可以逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別［1］。Krampera等［2］研究BMSCs可以抑制T細(xì)胞增殖，但多數(shù)關(guān)于BMSCs免疫抑制效應(yīng)的研究都是在體外進(jìn)行的，其免疫逃逸和免疫抑制的確切機(jī)制尚不清楚。

2 BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

2.1 BMSCs的分離培養(yǎng)方法

2.1.1 全骨髓法 利用BMSCS的較強(qiáng)貼壁性對其進(jìn)行分離，而細(xì)胞的生存、生長需要的某些因子來自于與其伴生的其他細(xì)胞，該法在很大程度上模擬了體內(nèi)BMSCS的生長環(huán)境，含有的若干生長因子及促黏附物質(zhì)促進(jìn)了BMSCs的貼壁生長。該方法分離的BMSCs較均一，細(xì)胞活性高，增殖能力強(qiáng)，原代細(xì)胞首次融合僅需7～10 d。該法這也是最常用的方法之一。

2.1.2 貼壁篩選法 利用BMSCs具有在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長，而血細(xì)胞和造血干細(xì)胞細(xì)胞易懸浮生長的特性，逐步將非貼壁細(xì)胞核其他雜質(zhì)細(xì)胞去除的一種簡單易行的方法，但這種方法無法很好去除成纖維細(xì)胞，且獲得的細(xì)胞純度不夠。

2.1.3 密度梯度離心法 根據(jù)BMSCs與其他細(xì)胞密度不同而采用Ficoll或Percoll分離液，通過對骨髓液進(jìn)行梯度離心，去除骨髓中的血液成分，獲取界面的有核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。使用該方法分離的細(xì)胞純度較高，但此法常影響細(xì)胞的增殖活動(dòng)且操作較繁瑣。

2.1.4 免疫磁珠分選法 根據(jù)磁珠既可結(jié)合蛋白質(zhì)又可被磁鐵所吸附，經(jīng)過一定處理將抗體或抗原結(jié)合在磁珠上，使之成為抗體或與抗體結(jié)合后，形成抗原－抗體磁珠免疫復(fù)合物在磁力作用下，發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，從而達(dá)到分離特異性抗原或抗體的目的，該方法的優(yōu)點(diǎn)是避免了免疫毒素和補(bǔ)體裂解帶來的非特異性殺傷作用，并可以處理大量的細(xì)胞樣品。但抗體價(jià)格昂貴，普及推廣受到限制。

2.2 BMSCs的鑒定 (1)形態(tài)學(xué)鑒定：BMSCs呈梭形，細(xì)胞扁平，胞體狹長，核呈橢圓形，貼壁生長，成漩渦狀或輻射狀排列。(2)流式細(xì)胞儀檢測：CD29、CD44陽性;CD34、CD45陰性［3］。(3)BMSCs具有體外誘導(dǎo)分化為已知細(xì)胞的能力，目前普遍鑒定BMSCs常用的方法是：檢測細(xì)胞分化后產(chǎn)生礦化或骨樣化結(jié)節(jié)。

3 影響B(tài)MSCs向成骨細(xì)胞分化的因素與成骨細(xì)胞鑒定

3.1 誘導(dǎo)BMSCs成骨分化因素

3.1.1 化學(xué)藥物誘導(dǎo) 地塞米松 (dexamethasone，DEX)、β－甘油 磷酸 鈉 (sodium β－glycerophosphate，β－GP)和維生素 C(vitamin C，VitC)聯(lián)合應(yīng)用是BMSCs向成骨細(xì)胞分化和體外成骨的經(jīng)典誘導(dǎo)方法，為最常用的成骨誘導(dǎo)劑。低劑量的DEX對BMSCs向成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用，隨著DEX濃度的升高這種促進(jìn)作用減弱甚至轉(zhuǎn)而向脂肪細(xì)胞分化。DEX在促進(jìn)BMSCs骨向分化的同時(shí)可以抑制BMSCs的增殖，同時(shí)提高堿性磷酸酶 (ALP)的活性，誘導(dǎo)BMSCs分化表達(dá)骨鈣素，增加骨橋素和Ⅰ型膠原mRNA，提高BMSCs對甲狀旁腺激素和前列腺素E2反應(yīng)的cAMP水平［4］，同時(shí)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長因子，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原合成。體外培養(yǎng)的BMSCs只有加入DEX才能形成鈣化結(jié)節(jié)。Vit C是膠原中脯氨酸和賴氨酸末端羥基化的共同影響因子，能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異性分化蛋白基因的表達(dá)來誘導(dǎo)ALP活性的增加，并刺激Ⅰ型膠原的合成，同時(shí)能增加鈣鹽的沉積和促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)的形成［5］。β－GP能提供磷酸離子作為合成ALP作用的底物，誘導(dǎo)和激活A(yù)LP，產(chǎn)生大量磷酸根離子，促進(jìn)有機(jī)磷向無機(jī)磷轉(zhuǎn)化，加速鈣鹽沉著;而且可破壞鈣化抑制劑，從而啟動(dòng)鈣化，是BMSCs發(fā)生礦化結(jié)節(jié)沉積必要條件。

3.1.2 細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo) 骨形態(tài)發(fā)生蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍化生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和血管生長素等，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白是迄今為止已知的最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)形成因子，其靶細(xì)胞是血液中的BMSCS，其能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)成骨。Diefenderfer等［6］發(fā)現(xiàn)DEX誘導(dǎo)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化后對ALP有抗拒作用，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白可誘導(dǎo)大鼠及小鼠BMSCs的ALP的表達(dá)。

3.1.3 物理方法誘導(dǎo) 體外沖擊波、電磁場等物理機(jī)械刺激可經(jīng)MAPK通路促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［7］。

3.1.4 中藥提取物誘導(dǎo) 龜甲、大黃素、巴戟天、柚皮苷等可對BMSCS誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。

3.1.5 轉(zhuǎn)基因作用誘導(dǎo) 把具有成骨作用的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，由靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成mRNA于病變區(qū)翻譯成具有成骨作用的蛋白質(zhì)，通過靶細(xì)胞的持續(xù)作用，促進(jìn)自身成骨。2006年日本Yamanaka［8］率先報(bào)道了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究。他們把Oct3/4，Sox2，c－Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。

3.2 成骨細(xì)胞的鑒定

3.2.1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下，剛接種的成骨細(xì)胞呈球形，細(xì)胞懸液于培養(yǎng)液中并逐漸沉降貼壁，24 h后，存活細(xì)胞已完全貼壁展開，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈多角形，有較多突起，單核呈卵圓形，1～3個(gè)核仁，胞質(zhì)豐富，清晰。生長期細(xì)胞分離相多見，細(xì)胞突起互相連接，匯合時(shí)，細(xì)胞呈鋪路石狀，并可重疊生長，重疊生長的細(xì)胞逐漸形成細(xì)胞小結(jié)，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，形成不透光礦化結(jié)節(jié)。如不傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度增大，可逐漸失去極性，細(xì)胞形態(tài)不易辨認(rèn)。連續(xù)培養(yǎng)，可見胞體增大，胞質(zhì)稀薄，胞核縮小，分裂相少見等退行性改變。掃描電鏡觀察，可見骨細(xì)胞以長梭形為主，也有多邊形、橢圓形和不規(guī)則形，表面光滑，突起多而長，細(xì)胞間由突起相互連接，并重疊生長。少數(shù)細(xì)胞有分泌顆粒。連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞，可見細(xì)胞塌陷，突起減少等退行性改變。透射電鏡下可見成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，線粒體較多，還有溶酶體、基質(zhì)小泡及糖原顆粒;細(xì)胞核大而圓，位于胞體一側(cè)，核膜清晰，核質(zhì)均勻。在原代培養(yǎng)的骨組織中可見細(xì)胞表面有粗而長的骨小管，骨細(xì)胞突起，胞漿內(nèi)除有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外，還有分泌小泡和糖原顆粒，細(xì)胞外有鈣鹽沉積在類骨質(zhì)中。連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞，胞質(zhì)中顯示糖原顆粒堆積。

3.2.2 源于BMSCs的成骨細(xì)胞生物學(xué)特性ALP：成骨細(xì)胞具有合成分泌ALP功能，功能活躍的成骨細(xì)胞內(nèi)ALP組織化學(xué)染色陽性?；|(zhì)前體染色：成骨細(xì)胞可大量合成骨基質(zhì)成分，組織化學(xué)PAS染色可顯示成骨細(xì)胞胞質(zhì)中大小不一的紅色顆?；驁F(tuán)塊狀陽性物質(zhì)。膠原蛋白：Ⅰ型膠原蛋白免疫組化染色，可見成骨細(xì)胞經(jīng)染色后呈棕色;Ⅲ型膠原染色片中成骨細(xì)胞偶呈淡棕色，表明成骨細(xì)胞產(chǎn)生少量Ⅲ型膠原，而主要合成Ⅰ型膠原。成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)：成骨細(xì)胞具有體外礦化的特征，表現(xiàn)為肉眼可見的白色礦化結(jié)節(jié)，是成骨細(xì)胞骨形成功能的形態(tài)表現(xiàn)，通常用茜素紅法、Von Kossa法及四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記法染色顯示成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)，Von Kossa法礦化結(jié)節(jié)呈黑色，四環(huán)素標(biāo)記法呈黃色發(fā)光結(jié)節(jié)。另外，通過礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)，可反映成骨細(xì)胞的礦化功能。雌激素受體測定：成骨細(xì)胞上存在雌激素受體，可采用3H標(biāo)記雌二醇放射性受體分析法，定量檢測成骨細(xì)胞上雌激素受體含量。

3.2.3 成骨細(xì)胞功能測定 增殖率測定：成骨細(xì)胞的增殖率直接反映細(xì)胞的生長情況，常用MTT比色法測定，已被廣泛應(yīng)用。ALP比活性檢測：檢測ALP比活性，可反映成骨細(xì)胞分泌ALP的功能以及成骨細(xì)胞的分化程度。分泌蛋白測定：成骨細(xì)胞是典型的分泌蛋白型細(xì)胞，具有合成分泌多種蛋白質(zhì)的功能，其中骨鈣素、胰島素樣生長因子1、Ⅰ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β與成骨細(xì)胞分化和骨形成功能密切相關(guān)。相關(guān)基因mRNA測定：用分子生物學(xué)方法RT－PCR技術(shù)檢測成骨細(xì)胞骨鈣素、胰島素樣生長因子1、Ⅰ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β、成骨生長肽等的mRNA表達(dá)水平，可反映成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)。鈣攝取功能測定：成骨細(xì)胞具有攝取和釋放鈣的功能，可用放射性核素標(biāo)記45Ca測定成骨細(xì)胞的鈣攝取功能。

4BMSCs 臨床應(yīng)用

4.1 BMSCs在治療骨不連中的應(yīng)用 Hemigou等［9］經(jīng)皮注射富含 BMSCs的骨髓治療骨不連患者，其中90%獲得成功治愈，未治愈的7例患者所接受的骨髓移植物中可形成成骨細(xì)胞的BMSCs平均濃度低于103個(gè)/cm3，所含總量低于3×104，不論是平均濃度，還是所含細(xì)胞總量都低于那些成功治愈的患者。提示移植物所含成骨前體細(xì)胞的濃度不應(yīng)低于103個(gè)/cm3。

4.2 BMSCs在治療成骨不全中的應(yīng)用 因BMSCs具有多向分化潛能，Horwitz等［10］使用同種異體骨髓治療成骨不全的兒童，在植入骨髓3個(gè)月后，骨樣本組織學(xué)提示新骨形成。患者本身骨礦物質(zhì)含量較正常健康小孩明顯增加，表明同種異體骨髓可以引導(dǎo)功能性BMSCs植入促進(jìn)新骨形成，提示BMSCs治療成骨不全的可行性。

4.3 BMSCs在骨組織工程中的應(yīng)用 骨髓中BMSCs含量極少，隨年齡增長而成幾何級(jí)數(shù)下降，因此利用BMSCs的自我擴(kuò)增能力，將其在體外大量擴(kuò)增，然后用于治療。BMSCs不僅可以在體外一定的條件下分化為成骨細(xì)胞，且其黏附于一定的載體在體內(nèi)也可以分化為成骨細(xì)胞，應(yīng)用于骨缺損。Srouji等［11］把鼠的BMSCs種植到水凝膠上然后移植到老鼠的脛骨缺損處，6周后觀察脛骨缺損處有水凝膠的免疫標(biāo)記，且有完整的新骨生成。Shin等［12］把犬的BMSCs種植到部分脫鈣的骨基質(zhì)上來修復(fù)犬的股骨末端的骨缺損，6個(gè)月后骨缺損完全修復(fù)，這一研究為臨床應(yīng)用非骨水泥修復(fù)關(guān)節(jié)的缺損成型提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Alhadlaq等［13］用聚乙二醇凝膠安入顳下頜關(guān)節(jié)踝的解剖形態(tài)制作出假體，取小鼠BMSCs分別向軟骨和成骨方向誘導(dǎo)后分層種植于假體上，然后將假體植入小鼠背部皮下，4周后發(fā)現(xiàn)植入的細(xì)胞分別表達(dá)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的表面標(biāo)記物，并形成類軟骨和類骨基質(zhì)。

5 問題與展望

盡管近年來對BMSCs的研究取得了很大進(jìn)展，但仍然存在尚待解決的問題：(1)骨髓中細(xì)胞成分比較混雜，BMSCs在骨髓中含量約為0.001%～0.01%，并隨年齡的增加或體質(zhì)的衰弱，BMSCs數(shù)量逐漸減少，對BMSCs進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用就必須進(jìn)行體外分離純化并大量增殖，建立一套完整有效的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定方法體系，在保持干細(xì)胞特性的前提下，實(shí)現(xiàn)快速大規(guī)模的擴(kuò)增，成為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中迫切需要解決的問題。(2)BMSCs的鑒定，鑒定BMSCs的方法很多，但還沒有十分可靠的準(zhǔn)確鑒定方法，大多數(shù)方法還是通過培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的分化表型來推論是否為BMSCs。因此，怎樣準(zhǔn)確快速地鑒定BMSCs仍是目前的一道難題。(3)BMSCs異質(zhì)性研究，BMSCs的來源多種多樣，為臨床MSCs的適合來源提供了依據(jù)。但這些不同來源的MSCs之間存在哪些差異，相互間有何相互影響，以及在不同組織中的密度等均有待于進(jìn)一步闡明。(4)干細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制，Orkin等［14］認(rèn)為體內(nèi)可能不存在 BMSCs，只是在培養(yǎng)分離到的細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞被激發(fā)轉(zhuǎn)變或者程序重調(diào)，成為具有胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞，事實(shí)是否如此還需深入研究。因此，揭示干細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制的研究，干細(xì)胞移植的免疫問題，影響干細(xì)胞移植成功的因素如干細(xì)胞的來源、干細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)、自然凋亡過程、宿主提供的微環(huán)境，都是有待深入研究和亟待解決的問題。

盡管如此，由于BMSCs具有多向分化潛能和高增殖特性，取材容易，對機(jī)體損傷小，易于基因操作，組織相容性好等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是組織工程和基因工程理想的靶細(xì)胞，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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