張 蕾，常 宏，徐 東

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部生物化學(xué)教研室，河北石家莊050091）

·論 著·

利用雙雜交系統(tǒng)篩選并鑒定與GPR30相互作用的蛋白

張 蕾1，常 宏2*，徐 東1

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部生物化學(xué)教研室，河北石家莊050091）

目的篩選并鑒定與GPR30相互作用的蛋白，為GPR30蛋白亞細(xì)胞定位和功能研究提供線索。方法應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，構(gòu)建誘餌表達(dá)載體Pgbk/GPR30，與人卵巢互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）文庫共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，篩選陽性克隆并測序。利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證GPR30與候選蛋白的相互作用。結(jié)果從人卵巢cDNA文庫中篩選出4個與GPR30結(jié)合的蛋白基因，分別是小G蛋白Rab8a、Rab40a、NM23-H2和TACC3。其中，小G蛋白Rab8a、Rab40a與GPR30的相互作用在哺乳動物雙雜交系統(tǒng)中得到驗(yàn)證。結(jié)論小G蛋白Rab8a和Rab40a可能參與了GPR30細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)或與GPR30參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

受體，雌激素；雙雜交系統(tǒng)技術(shù)；卵巢

雌激素是一種重要的內(nèi)分泌激素，尤其對維持女性多種器官的生理功能具有不可替代的作用，并與乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在細(xì)胞分子水平上，雌激素的作用是通過細(xì)胞內(nèi)雌激素受體（estrogen receptor，ERα）介導(dǎo)的。ERα與ERβ作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能已被廣泛研究。但20世紀(jì)90年代，一種新型的ER即G蛋白耦聯(lián)受體30（G protein-coupled receptor 30，GPR30）被數(shù)個研究團(tuán)隊(duì)相繼分離出來。GPR30在不表達(dá)ER與ER的靶器官中參與對雌激素的生理反應(yīng)，并且與乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［1－4］。但是，目前對GPR30的功能尚不十分明確，尤其是亞細(xì)胞功能定位與參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍有很大爭議［5－7］。為此，本研究結(jié)合酵母雙雜交與哺乳動物雙雜交系統(tǒng)，從人卵巢cDNA文庫中篩選與GPR30相互作用的蛋白，旨在為進(jìn)一步研究GPR30功能提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料：大腸桿菌JM109為河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部生物化學(xué)教研室保存。酵母菌株AH109，營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基，pGBK質(zhì)粒與matchmaker人卵巢cDNA蛋白表達(dá)文庫為Clontech公司產(chǎn)品。CheckMate Mammalian Two-Hybrid System與Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司。DNA重組所用限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，PCR相關(guān)試劑，膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自TAKARA公司。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購自Invitrogen。HEK293細(xì)胞株為贈送。引物合成及測序由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：PCR擴(kuò)增GPR30全長，上下游引物5′端分別引入EcoRI與BamHI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收與pGBKT7載體同時(shí)用EcoRI與BamHI雙酶切。酶切產(chǎn)物回收后以T4DNA連接酶連接。重組質(zhì)粒pGBK-GPR30以測序鑒定。

1.2.2 誘餌蛋白毒性和自激活檢測：將空質(zhì)粒pGBKT7與重組質(zhì)粒pGBKT7-GPR30分別轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)72h。挑取單克隆菌落至液體SD/-Trp培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)24h，比較兩者光密度600（optical density 600，OD600）值，明確GPR30蛋白對酵母菌株AH109有無毒性。將pGBKT7-GPR30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AH109細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分別鋪在不同的缺陷培養(yǎng)板SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp上，30℃96h觀察酵母生長情況。

1.2.3 人卵巢cDNA文庫篩選：將等量的pGBKT7-GPR30質(zhì)粒與文庫質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化AH109細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪在50個直徑150mm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)至克隆出現(xiàn)（6～9d）。

1.2.4 陽性文庫質(zhì)粒的分離：利用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取酵母質(zhì)粒，氯化鈣法轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪LB/Amp板，提取陽性菌落質(zhì)粒。

1.2.5 陽性質(zhì)粒的酶切分類和再驗(yàn)證；將篩選出的陽性質(zhì)粒，用內(nèi)切酶HindⅢ酶切并進(jìn)行電泳，將相對分子質(zhì)量一致的質(zhì)粒歸為一組。每組選取1個質(zhì)粒與pGBKT7-GPR30質(zhì)粒以一對一方式再次轉(zhuǎn)化AH109細(xì)胞，在SD/-Ade/-His/-Trp缺陷培養(yǎng)板上驗(yàn)證。驗(yàn)證陽性者送測序。測序結(jié)果利用美國國家生物技術(shù)信息數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對。

1.2.6 利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證：GPR30與候選蛋白的相互作用PCR擴(kuò)增GPR30全長，上下游引物5′端分別引入BamHI與KpnI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收與pBIND載體同時(shí)用BamHI與KpnI雙酶切。酶切產(chǎn)物回收后以T4DNA連接酶連接。以同樣方法將候選基因插入pACT質(zhì)粒中。將GPR30-pBIND與候選基因-pACT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，按照Dual-luciferase reporter assay system說明書進(jìn)行操作，檢測熒光素酶報(bào)告基因活性。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI與BamHI酶切，有約1120bp片段插入（圖1）。測序表明插入片段與GPR30開放閱讀框序列完全相符，無堿基突變和缺失，插入方向正確，未發(fā)生讀碼框架改變。

2.2 誘餌蛋白的毒性和自激活檢測：pGBKTGPR30與pGBKT7轉(zhuǎn)化的AH109酵母細(xì)胞培養(yǎng)24h后，OD600分別為1.033與1.041，表明誘餌蛋白對AH108細(xì)胞無明顯毒性。

對照pGBKT7-GPR30轉(zhuǎn)化的AH109酵母細(xì)胞在SD/-Trp培養(yǎng)板上的生長情況，在SD/-His/-Trp和SD/-Ade/-Trp培養(yǎng)板上無克隆生長，證明pGBKT-GPR30質(zhì)粒對報(bào)告基因無自激活作用（圖2）。

2.3 文庫篩選及陽性克隆鑒定：pGBKT-GPR30與人卵巢cDNA文庫共轉(zhuǎn)化AH109酵母細(xì)胞后，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培養(yǎng)基上獲得46個克隆。全部克隆經(jīng)酵母質(zhì)粒提取后，再在大腸桿菌JM109中擴(kuò)增。將46個質(zhì)粒以HindⅢ酶切并進(jìn)行電泳。相同大小的酶切片段視為同一插入片段。這樣，共得到8組陽性克隆質(zhì)粒。將這8個質(zhì)粒與pGBKT-GPR30一對一轉(zhuǎn)化AH109細(xì)胞進(jìn)一步排除假陽性，最終得到6個陽性克?。▓D3）。測序及比對結(jié)果表明，有2個為線粒體蛋白，是常見的假陽性序列。其余4個克隆，分別編碼Rab8a、Rab40a、GGA3和TACC3蛋白，做進(jìn)一步鑒定（圖4）。

2.4 陽性克隆的哺乳動物雙雜交鑒定：將Rab8a、Rab40a、GGA3和TACC3編碼序列插入pACT載體，與GPR30-pBIND載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶含量表明，Rab8a和Rab40a攜帶的報(bào)告基因成功激活螢火蟲熒光素酶表達(dá)（圖5）。

3 討 論

GPR30可與雌激素特異性結(jié)合并介導(dǎo)環(huán)磷酸腺苷活化，但其作用模式和效應(yīng)與ER不同，且與ER沒有同源性［8］。同時(shí)，GPR30具有經(jīng)典的7次跨膜結(jié)構(gòu)，屬G蛋白耦聯(lián)受體家族。因此，可視為一種新型的雌激素膜性受體。但是，還未揭示GPR30是如何參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，甚至其亞細(xì)胞定位仍存在很大爭議。有報(bào)道［5］指出，在共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白標(biāo)記的GPR30主要集中在COS-7細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。但亦有報(bào)道［9］指出HEK293細(xì)胞中GPR30表達(dá)在細(xì)胞膜上。本實(shí)驗(yàn)利用酵母和哺乳動物雙雜交系統(tǒng)成功地篩選到2個可能的GPR30相互作用蛋白，Rab8a和Rab40a，為進(jìn)一步研究GPR30的亞細(xì)胞定位和參與的信號途徑提供了線索。Rab蛋白是小分子三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白家族中最大的亞家族。在人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過60余種Rab蛋白，它們廣泛參與細(xì)胞內(nèi)囊泡的運(yùn)輸，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)各種蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的正確運(yùn)輸和分配［10］。其中Rab8更是被報(bào)道參與GPCR從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞膜的定向運(yùn)輸［11］。而Rab40，至今并沒有深入的細(xì)胞功能研究。我們推測，或許Rab8和Rab40在不同細(xì)胞和組織的表達(dá)差異，造成了GPR30在不同的細(xì)胞模型中有不同的亞細(xì)胞定位。本實(shí)驗(yàn)利用酵母雙雜交與哺乳動物雙雜交系統(tǒng)相結(jié)合的方法，對尋找結(jié)構(gòu)復(fù)雜蛋白的相互作用蛋白進(jìn)行了探索。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，由于蛋白質(zhì)表達(dá)在酵母細(xì)胞中，往往不能象在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行正確的三維折疊和翻譯后修飾，從而易造成假陽性。因此，酵母雙雜交的結(jié)果通常要進(jìn)行免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。而GPR30屬7次跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，存在大量的疏水區(qū)，在相對溫和的細(xì)胞裂解液中不易溶解。在含有較強(qiáng)變性劑的細(xì)胞裂解液中，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用又容易被破壞。因此，利用免疫共沉淀驗(yàn)證多次跨膜受體的相互作用蛋白易造成假陰性。因此，在設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)做進(jìn)一步驗(yàn)證。哺乳動物雙雜交系統(tǒng)具有與酵母雙雜交系統(tǒng)相同的作用原理，但是蛋白在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，其構(gòu)象和修飾接近生理狀態(tài)，容易排除假陽性［12］。本實(shí)驗(yàn)中，NM23-H2和TACC3由于無法在哺乳動物雙雜交系統(tǒng)中得到證明而被排除。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功鑒定出與GPR30相互作用的2個蛋白——同屬小G蛋白家族的Rab8和Rab40，為進(jìn)一步研究GPR30在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)提供了線索。（本文圖見封二）estrogen receptor，GPR30，with breast tumor metastasis and transactivation of the epidermal growth factor receptor［J］.Steroids，2008，73（9/10）：870－873.

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（本文編輯：趙麗潔）

［1］FILARDO EJ，QUINN JA，SABO E.Association of themembrane

SCREENING OF GPR30 INTERACTING PROTEINS BY TWO-HYBRID SYSTEM

ZHANG Lei1，CHANG Hong2*，XU Dong1
（1.Department of Cardiology，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China；2.Department of Biochemistry，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China）

receptors，estrogen；two-hybrid system techniques；ovary

R349.81

A

1007-3205（2013）04-0378-03

2013－02－25；

2013－04－02

張蕾（1974－），女，湖北武漢人，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事影像學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)診斷研究。

*通訊作者。E-mail：ch720321＠126l.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.003

【關(guān)鍵詞】ABSTRACT：ObjectiveTo screen and identify the GPR30 interacting proteins and provide clues for GPR30 protein subcellular localization and cellular function.M ethodsThe bait expression vector pGBK/GPR30 was constructed and co-transformed with human ovarian cDNA library into yeast AH109 cells for yeast two-hybrid screening.Candidate interacting proteins were confirmed by mammalian twohybrid system.ResultsThe genes coding for four proteins that can bind to GPR30 were selected from human ovarian cDNA library，small G proteins Rab8a，Rab40a，NM23-H2 and TACC3.And the interaction between GPR30 and small G proteins Rab8a，Rab40awas confirmed bymammalian two-hybrid system.Conclusion Small G proteins Rab8a and Rab40amay be involved in the intracellular transport of GPR30 or GPR30 mediated signal transduction by direct interaction.