趙 卉，廖 勇，楊蓉婭

1 真菌生物膜感染的重要性

免疫缺陷狀態(tài)、廣譜抗生素的使用、手術(shù)造成黏膜屏障的破壞、放療和化療、腸外營養(yǎng)以及留置導管的廣泛應用，使得真菌已成為重要的院內(nèi)感染相關(guān)病原菌。念珠菌已成為院內(nèi)重癥監(jiān)護患者菌血癥的第三大常見病原菌，也是真菌相關(guān)生物膜感染的最常見病原菌。白念珠菌細胞黏附于留置醫(yī)療器械表面，形成生物膜結(jié)構(gòu)，并引起真菌血癥及播散性感染；這種植入物相關(guān)感染很難根治，需要通過移除植入物和長期的抗真菌治療才能達到滿意療效。此外，光滑念珠菌，近平滑念珠菌，克柔氏念珠菌及熱帶念珠菌也可以引起導管相關(guān)醫(yī)源性和醫(yī)療植入物相關(guān)感染[1]。其他真菌也可以引起生物膜相關(guān)感染，包括球孢菌屬、曲霉菌屬、接合菌屬、芽生裂殖菌屬、馬拉色菌屬、毛孢子菌屬和隱球菌屬等[2]。

隨著研究的深入，科學家逐漸發(fā)現(xiàn)不同種類的真菌均具有形成生物膜的能力。通過對白念珠菌生物膜的研究，對真菌生物膜形成過程中的分子機制也有了一定認識[1,2]。病原真菌生物膜的形成是目前臨床抗真菌治療反應不佳的重要原因，而清除生物膜所需抗真菌藥的血藥濃度卻遠超出了臨床治療的上限。

2 生物膜基礎(chǔ)研究

細菌和真菌均可在單個分散游離狀態(tài)與固著多細胞群落狀態(tài)間相互轉(zhuǎn)換，后者通常就是生物膜狀態(tài)。生物膜是一種附著于介質(zhì)或細胞間相互黏著的高度結(jié)構(gòu)化細胞群落，由其自身產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)所包裹[2]。環(huán)境中約80%的微生物存在于生物膜群落中，微生物形成生物膜可以使其適應環(huán)境，抵抗各種外源性應激、壓力，提高代謝的協(xié)同作用。近年來，真菌生物膜的致病性日益受到臨床關(guān)注。生物膜不僅可以為其提供庇護（特別是對抗真菌藥物的耐受性[2]），也為微生物的持續(xù)性感染創(chuàng)造條件，且涉及越來越多的免疫缺陷人群[1]。真菌生物膜的形成是一個連續(xù)過程，包括黏附于介質(zhì)表面、形成微菌落、細胞外基質(zhì)的分泌、微菌落融合形成生物膜、生物膜成熟、真菌細胞從生物膜中釋放出來、形成新的生物周期。病原真菌細胞常常黏附和定植于留置導管、植入物及黏膜的表面，包括周圍基質(zhì)（尿液、血液、 唾液和黏液）的化學成分、流動性、pH 值、溫度、滲透壓、細菌、抗感染藥物以及宿主的免疫狀態(tài)等，多種因素影響真菌生物膜的形成與成熟[3]。

3 生物膜耐藥性研究

早期對生物膜耐藥性的研究是通過對其基本表型水平的描述性分析來評價抗真菌藥物的作用。干重法、四氮唑溴鹽（MTT）還原反應、亮氨酸摻入法及靜態(tài)和動態(tài)模型可用于研究白念珠菌生物膜活力及生物膜對抗真菌藥敏感性的變化[4]。但上述模型構(gòu)建繁瑣，因此，高效快速的二甲氧唑黃（XTT）比色法開始逐步應用于酵母菌的黏附力和藥敏的研究[5]。但XTT 比色法對生物膜的特征不能進行量化分析，因此，這種方法僅適用于直接的、孤立的、未經(jīng)處理的對照研究，而非絕對定量分析生物膜形成本身。Martinez 和 Casadevall[6]于2006 年開發(fā)了一種基于微量滴定板來檢測新生隱球菌生物膜對藥物的敏感性。96 孔微量培養(yǎng)板已用于曲霉生物膜的藥敏檢測，XTT 簡化法和阿拉馬藍法用于研究分生孢子、菌絲的耐藥性[7]。

生物膜周圍液體的流動性可以改變其對藥物的敏感性[4]，越來越多的流體生物膜模型體系被構(gòu)建并用于生物膜的研究[3]。Lopez Ribot 研究小組最近研究了一種簡單的以重力為基礎(chǔ)的流體真菌生物膜模型，構(gòu)建的生物膜較厚且對多烯類和棘白菌素類抗真菌藥的耐藥性更強。此外，目前已經(jīng)構(gòu)建了許多用于體內(nèi)研究的生物膜模型，包括皮下植入模型、靜脈導管模型、陰道模型及義齒模型[7],這有助于進一步研究真菌生物膜的體內(nèi)耐藥性。

4 真菌生物膜耐藥機制

對抗真菌藥物的耐藥性是生物膜的重要特征。研究顯示，真菌生物膜比浮游細胞耐藥性高1 000 倍左右，但其耐藥機制尚未完全闡明[8]。盡管一些抗真菌藥物（棘白菌素和脂質(zhì)體兩性霉素B）能夠抑制真菌生物膜，但生物膜復雜結(jié)構(gòu)所致的內(nèi)源性耐藥機制有待于進一步研究[9]。真菌對抗真菌藥物的耐藥較復雜，可以是化合物的誘導反應，或?qū)拐婢幍拈L期暴露引起的不可逆轉(zhuǎn)的遺傳學變化?？拐婢退帣C制包括靶分子的改變或過度表達，流出泵的外排，細胞外基質(zhì)的分泌，應激反應及細胞密度升高等。

4.1 生長條件

菌群的生長環(huán)境特征影響著生物膜的藥物敏感性。葡萄糖和鐵離子使白念珠菌生物膜對兩性霉素B 的耐藥性升高[10]。此外，在缺氧狀態(tài)下形成的白念珠菌生物膜對兩性霉素B 和唑類抗真菌藥物具有較高的耐藥性。pH值、溫度、氧氣及環(huán)境變化等其他影響因素都會影響生物膜的結(jié)構(gòu)及對抗真菌藥的敏感性[6]。在pH 為7.0 的中性環(huán)境中，白念珠菌黏附聚苯乙烯表面的能力更強[6]，與在YNB 中形成的生物膜相比，在RPMI1640 培養(yǎng)基中形成的生物膜對卡泊芬凈更加耐受。有研究顯示，念珠菌可以在厭氧環(huán)境（如牙周袋）及缺氧條件下形成生物膜，并導致多種感染[11]。

4.2 細胞密度

酵母狀態(tài)和絲狀結(jié)構(gòu)并存的生物膜菌群中，細胞密度是生物膜產(chǎn)生耐藥性，特別是對唑類藥物耐藥的重要因素。游離細胞和重懸的生物膜細胞在低細胞數(shù)量（103個/ml）時對唑類藥物敏感，當細胞密度增長后耐藥性也隨之增加[12]，這種現(xiàn)象在煙曲霉生物膜中也可觀察到。生物膜耐藥性的調(diào)控通路尚不清楚，且棘白菌素類藥物具有較強的抗生物膜作用，也說明細胞密度的影響是有限的[13]。此外，與浮游細胞相比，生物膜重懸分離細胞仍具有一定耐藥性，說明生物膜還存在其他耐藥機制[7]。

4.3 藥物靶點的過度表達

唑類藥物對白念珠菌的抑制作用引起了菌群的自然選擇可達到誘導耐藥作用。ERG11 基因的點突變（S405F，Y132H，R467K 和G464S 突變）或過度表達與其耐藥的關(guān)系比較明確[14]。通過基因芯片對白念珠菌的研究發(fā)現(xiàn)，其生物膜狀態(tài)CaERG25 和CaERG11 基因出現(xiàn)過度表達[15]。生物膜的早期和晚期麥角固醇生物合成相關(guān)CaERG1，CaERG3，CaERG11 以及 CaERG25 的表達上調(diào)可以導致真菌對氟康唑耐藥。特別是22 h 生物膜形成后，CaSKN1 及CaKRE1 的中度上調(diào)可導致生物膜對兩性霉素B 耐受[16]。同樣，近平滑念珠菌生物膜中也出現(xiàn)了麥角固醇合成基因的表達上調(diào)，以及對唑類藥物的耐受。

4.4 藥物外排泵

ABC 轉(zhuǎn)運蛋白超家族（ATP-binding cassette transporter superfamily，ABC）和易化載體蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）是白念珠菌對唑類耐藥的主要機制[17]。多種抗真菌藥均可以作為這兩種轉(zhuǎn)運蛋白的底物，它們的過度表達可導致不同藥物之間的交叉耐藥性，特別是唑類藥物。生物膜對棘白菌素類抗真菌藥物的敏感性也受到外排泵的影響[18]。生物膜藥物外排泵基因包括CaCDR1、CaCDR2 和CaMDR1[19]，在生物膜形成過程中均有表達，特別是在暴露于抗真菌藥后出現(xiàn)表達上調(diào)。在生物膜形成的24 h 和48 h，CaCDR1 和CaCDR2 的表達出現(xiàn)上調(diào)，CaMDR1 在第24 h 出現(xiàn)短暫上調(diào)[20]。動物研究表明,植入導管相關(guān)生物膜也有外排泵基因的表達[16]，在12 h，CaCDR2 轉(zhuǎn)錄基因上調(diào)1.5 倍，CaMDR1 在12 h 和24 h 分別上調(diào)2.1倍和1.9 倍[15]。對光滑念珠菌的研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜形成的早期(6 h)、中期(15 h)及晚期(48 h)，CgCDR1 和CgCDR2 均有表達。與浮游細胞相比，CgCDR1 上調(diào)1.5 ～3.3 倍，CgCDR2 上調(diào)0.5 ～3.1 倍[21]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜形成晚期，藥物外排泵的缺失可以導致白念珠菌生物膜耐藥性降低[12]。

4.5 細胞外基質(zhì)

細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是真菌生物膜的重要特征，幫助細胞對抗宿主免疫系統(tǒng)和抗真菌藥物所致?lián)p害[3]。ECM 阻止或延遲了藥物的滲入，最新的研究顯示ECM 的化學成分及其調(diào)控機制在生物膜耐藥過程中發(fā)揮重要作用[22]。β-1,3 葡聚糖是碳水化合物主要組成部分，可以通過抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶，從而抑制生物膜的形成[4]。此外，β-1,3 葡聚糖酶可明顯增加氟康唑和兩性霉素B 的活性。外源性給予生物膜ECM 和β-1,3 葡聚糖可降低氟康唑體外抗真菌活性。研究表明，β-1,3 葡聚糖可以螯合唑類抗真菌藥物，稱之為“藥物海綿”，是白念珠菌生物膜耐藥的重要原因[23]。此外，β-1,3 葡聚糖還與棘白菌素類，嘧啶類和多烯類抗真菌藥物的耐藥性有關(guān)。白念珠菌ECM 的產(chǎn)生受到多方面調(diào)控，ECM 不僅是白念珠菌生物膜也是非白念珠菌生物膜，如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和都柏林念珠菌產(chǎn)生耐藥性的重要因素。

4.6 應激反應

應激反應已被證實是抗真菌藥耐受的重要機制。病原真菌需要面對多種來源的生理應激，包括溫度、離子、滲透壓和氧化應激[14]，這些應激原與不同的受體結(jié)合，通過傳統(tǒng)信號通路引起反應,通過應激反應參與生物膜的形成。此外，與野生型和游離菌株相比，Mck1p 基因突變株對唑類藥物敏感，表明Mck1p 通過應激通路參與生物膜的耐藥性。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是白念珠菌對唑類耐藥的關(guān)鍵，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶與體內(nèi)外生物膜對唑類抗真菌藥物耐受的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[24]。熱休克蛋白90(Hsp90)通過復雜的細胞通路對真菌生物膜進行調(diào)節(jié)，并增強了白念珠菌生物膜對唑類和棘白菌素類抗真菌藥物的耐受，其中部分是通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶起作用[25]。Hsp90 可以物理性地催化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的亞基，且保持其穩(wěn)定及其活性。Cowen 和Lindquist[25]以及Singh 等[26]通過研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90 基因的缺失抑制了白念珠菌生物膜的生長和體外細胞的成熟，并引起生物膜細胞的離散，同時降低白念珠菌生物膜對唑類抗真菌藥的耐受。煙曲霉Hsp90 的缺失會導致生物膜對棘白菌素類抗真菌藥物的耐受性降低[27]。此外，光滑念珠菌生物膜蛋白質(zhì)組的研究表明，熱休克蛋白12（Hsp12p）和其他反應蛋白質(zhì)（Trx1p，Pep4p）的表達上調(diào)也與生物膜耐藥性相關(guān)[28]。

5 總結(jié)

真菌生物膜的耐藥機制由復雜的、多種機制共同參與，包括一些基本的物理性屏障作用和一些復雜的調(diào)控過程。外排泵主要在生物膜形成的早期到中期逐漸發(fā)揮作用，后期ECM 的產(chǎn)生也增強了生物膜的耐藥性。成熟而致密的生物膜形成的物理屏障和環(huán)境壓力下的低生長代謝率均有利于生物膜的生存。此外，致密生物膜可以抑制抗真菌藥物的滲透，菌絲生長及麥角固醇同樣影響生物膜的耐藥性，環(huán)境中應激反應蛋白質(zhì)發(fā)揮著保護和維持生物膜穩(wěn)定性的作用?？傮w而言，生物膜耐藥性是受多方面調(diào)控的動態(tài)平衡的過程。

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