萬本愿，李勝遠，姜青龍綜述

(江西省臨床檢驗中心，江西南昌330006)

自身抗體檢測的臨床應(yīng)用與質(zhì)量控制

萬本愿，李勝遠，姜青龍綜述

(江西省臨床檢驗中心，江西南昌330006)

自身免疫性疾病(AID)是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。檢測項目包括：抗核抗體(ANA)、抗可提取性核抗原抗體(ENA)、抗嗜中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)等近百種自身抗體。檢測方法主要有間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法等多種方法。試驗場所與試驗過程中的顯微鏡、酶標儀、試劑盒、質(zhì)控品等均應(yīng)符合要求，人員應(yīng)按標準操作程序操作,并做好自身抗體的全面質(zhì)量控制。

自身免疫性疾??；質(zhì)量控制

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。自身抗體的存在與自身免疫性疾病并非兩個等同的概念，自身抗體可存在于無自身免疫性疾病的正常人，特別是老年人，如抗甲狀腺球蛋白、甲狀腺上皮細胞、胃壁細胞、單鏈-DNA抗體等。近年來，自身抗體檢測在診斷自身免疫性疾病、判斷疾病的活動程度、觀察治療效果、指導(dǎo)臨床用藥等具有重要的作用。由于不同實驗室可能采用不同的抗原基質(zhì)，即使同樣的抗原基質(zhì)，其抗原固定方法也有差異或不同。另外，由于不同的血清稀釋方法以及操作者對不同熒光模式的識別能力的不同，均可影響到自身抗體的檢測質(zhì)量。

1 常見自身抗體檢測的臨床應(yīng)用

大多數(shù)自身免疫性疾病患者的血清中可檢測到高效價的自身抗體，雖然有些自身抗體在疾病中的作用尚未被證實，但其與疾病的相關(guān)性已獲得認可。特別是有些自身抗體的檢測已納入到某些自身免疫性疾病的診斷標準中，這些自身抗體的檢測對自身免疫性疾病的診斷和鑒別診斷及愈后評估具有重要的臨床意義。隨著對自身抗體的了解越來越深入，臨床應(yīng)用越來越廣泛，免疫學(xué)技術(shù)進一步的提高，自身抗體檢測已是臨床免疫檢測的一項重要的實驗室指標。在診斷自身免疫性疾病、判斷疾病的活動程度、觀察治療效果、指導(dǎo)臨床用藥等具有重要的臨床意義。筆者簡單介紹一下自身抗體的臨床應(yīng)用。

1.1 抗核抗體(antinuclearantibody，ANA)是一組針對自身真核細胞的各種細胞核成分為靶抗原的自身抗體的總稱。ANA的性質(zhì)主要是IgG、也有IgM、IgA和IgD。其無器官和種屬的特異性，故該類抗體可與所有動物的細胞核發(fā)生反應(yīng)[1,2]?，F(xiàn)已證實ANA對很多自身免疫性疾病有診斷價值，在不同疾病中，特別是在風(fēng)濕性疾病中，其抗體譜有一定的特征性。此外，在橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、多發(fā)性動脈炎等患者中也可能檢測出ANA。ANA陽性已被美國風(fēng)濕病學(xué)會列位SLE的診斷標準之一。

1.2 抗雙鏈DNA抗體(double-strandedDNA，ds-DNA)抗體與細胞核的反應(yīng)位點是位于DNA(外圍區(qū))脫氧核糖磷酸框架上，又稱為天然DNA抗體,其靶抗原為雙螺旋DNA.對診斷SLE有較高的特異性，是SLE患者的特征性標志抗體。30%-90%的活動期SLE患者此抗體陽性。且抗體滴度的消長與SLE的活動程度相關(guān)。隨著疾病活動的控制，抗ds-DNA抗體滴度可以下降或消失，可作為治療監(jiān)測和預(yù)后評價的指標?？筪s-DNA抗體與DNA結(jié)合成為免疫復(fù)合物在腎小球基底膜沉積，或抗ds-DNA抗體直接作用于腎小球抗原造成SLE患者的腎損害?？筪s-DNA抗體陽性的患者較陰性患者發(fā)生腎炎的危險性高12倍[3]。

1.3 抗單鏈DNA(singlestrand-DNA,ss-DNA)抗體又稱為變性DNA抗體,其靶抗原為核糖或脫氧核糖。在SLE患者有較高的檢出率(50%～60%)，但結(jié)果缺乏疾病特異性，在其他風(fēng)濕病如混合性結(jié)締組織病，藥物誘導(dǎo)的狼瘡，硬皮病，皮肌炎，干燥綜合征，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等也有10%～70%的檢出率，有些正常老年人也存在[4]。

1.4 抗可提取性核抗原抗體(Anti extractable nucle-

arantigen antibody，ENA)此類抗蛋白可以溶于鹽水而被提取，故稱為可提取性核抗原。ENA是可提取核抗原的總稱，ENA屬非組蛋白的核蛋白，屬酸性蛋白抗原，是由許多小分子RNA(約100~215個核苷酸)與各自對應(yīng)的特定蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白顆粒(RNP)，該組成使其各自的抗原性得以增強，分子中不含DNA。主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scl-70抗原，不同的自身免疫性疾病可產(chǎn)生不同的抗ENA抗體。對彌漫性結(jié)締組織病的診斷尤為重要，但與疾病的嚴重程度及其活動度無明顯關(guān)系[5]。

1.5 抗嗜中性粒細胞胞漿抗體(anti neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是一組以人嗜中性粒細胞胞漿成分為靶抗原的抗體，ANCA是系統(tǒng)性血管炎的血清標志性抗體。ANCA有兩種類型:一種是細胞質(zhì)型(cytoplasmic ANCA，c-ANCA)；目前認為它即是嗜中性粒細胞嗜天青顆粒內(nèi)的，稱之為蛋白酶3(porteinase3)的中性蛋白酶；一種是核周型(perinuclear ANCA，p-ANCA)，p-ANCA的靶抗原比較復(fù)雜，主要有髓過氧化酶(MPO)、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶、溶菌酶和乳鐵蛋白等。與臨床多種小血管炎性疾病密切相關(guān)，c-ANCA陽性最主要見于Wegener肉芽腫以及全身性血管炎，特異性＞97%，敏感性在初發(fā)非活動期患者為50%，活動期患者可達100%。p-ANCA多見于顯微鏡下多血管炎、變態(tài)反應(yīng)性肉芽腫性脈管炎、壞死性新月體型腎小球腎炎[6]。

1.6 類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)是一種抗人或動物IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體，無種族特異性。與RA高度相關(guān)，70～90%的RA患者為RF陽性，是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標準之一。但RF陰性不能排除RA的診斷。除RF外，還有很多疾病RF陽性，如干燥綜合癥，混合性結(jié)締組織病，2型混合性冷球蛋白血癥，慢性活動性肝炎，亞急性戲劇性心內(nèi)膜炎，全身性紅斑狼瘡，多種細菌、真菌、螺旋體、寄生蟲、病毒感染。因此，RF陽性時應(yīng)結(jié)合臨床全面檢查，對其臨床意義作出綜合分析[7,8]。

1.7 抗角蛋白抗體(antikeratin antibody,AKA)又稱為抗絲集蛋白抗體(anti-filaggrin antibody,AFA)或抗角質(zhì)層抗體(anti corneum antibody,ASCA),AKA主要見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。在非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫病患者AKA的陽性檢出率極低。AKA與RF在診斷RA時具有顯著的相關(guān)性[10]。

1.8 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody，CCP)研究發(fā)現(xiàn)絲集蛋白中的瓜氨酸是抗原性表位的主要成分，用合成的環(huán)化瓜氨酸多肽(CCP)作為抗原基質(zhì)檢測?？弓h(huán)瓜氨酸肽抗體的檢測，是用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)早期診斷的一個高度特異的新指標，敏感性為50～78%，特異性為96%，早期患者陽性率可達80%[11,12]。

1.9 抗肝抗原自身抗體有多種，包括抗肝特異性脂蛋白(LSP)抗體、抗肝細胞膜抗原(LMA)抗體、抗線粒體抗體(AMA)、抗肝腎微粒體(LKM)抗體、抗平滑肌抗體(ASMA)和抗可溶性肝抗原和肝胰抗原(SLA/LP)抗體等。這些自身抗體在區(qū)分病毒性肝炎及自身免疫學(xué)肝炎(AIH)分型中具有重要的臨床意義[13-15]。

1.10 抗胰島細胞抗體(anti islet cell antibody,ICA)是胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM)患者中最常見的自身抗體。新確診的IDDM患者其APICA的陽性檢出率可達90%以上。通常在治療一年后該抗體水平下降[16]。

2 自身抗體的檢測方法

2.1 間接免疫熒光法(indirect immunofluorescent method,IIF)是一種作為總的ANA篩選的經(jīng)典試驗，IIF檢測在過去最常用小鼠肝細胞印片作為抗原底物片，目前最常用的是核質(zhì)豐富的培養(yǎng)細胞—Hep-2細胞作為抗原。培養(yǎng)Hep-2細胞作為底物固定于載玻片上，與受檢血清反應(yīng)，血清中ANA與核抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，此時再加入FITC標記的抗人IgG，標記抗人IgG與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合形成標記抗體-抗原-抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下可觀察到底物片上ANA熒光著染強度和免疫熒光圖形。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA)酶免疫測定是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合，發(fā)展建立的一種非放射性標記免疫分析方法。由于ELISA具有靈敏度高、特異性強，酶免疫試劑的性質(zhì)比較穩(wěn)定，操作方法簡便快速、無放射性污染以及應(yīng)用范圍廣等很多優(yōu)點，是目前應(yīng)用最為廣泛的一項免疫學(xué)實驗。由于純化的或重組的抗原生產(chǎn)技術(shù)的成熟，商品化用于自身抗體檢測的高質(zhì)量的試劑盒已日漸增多，該法檢測自身抗體快速、敏感性及特異性強。由于該檢測方法的靈敏度高、特異性強、可量化且排除了人為的主觀判斷，費用低廉，是目前國外大多數(shù)自身免疫診斷檢測實驗

室的首選檢測方法。

2.3 免疫印跡法(Western-blot,WB)是屬于膜載體酶免疫技術(shù)，其固相載體為吸附有抗原的硝酸纖維膜。其基本原理是將從小?；蛲眯厍惶崛〉腅NA抗原，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，按分子量大小分離成區(qū)帶，經(jīng)參照對應(yīng)分子量標準物質(zhì)確定每一抗原區(qū)帶的分子量。然后將各抗原區(qū)帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上制成抗原吸附載體膜。將待檢血清加在已切成細條的硝酸纖維膜上，待檢血清中存在的抗ENA抗體分別與硝酸纖維膜上的相應(yīng)抗原區(qū)帶結(jié)合，當再加入酶標記抗人IgG抗體后形成抗原-抗體-酶標記抗體復(fù)合物，再加入酶的底物，出現(xiàn)顯色反應(yīng)，參照此時抗原區(qū)帶的分子量及各區(qū)帶的相對位置，可辯讀出各特異性抗ENA抗體。主要用于ANA陽性患者對單一抗原成分特異性自身抗體的確診分析[17]。

2.4 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性物質(zhì)標記的抗體對待檢樣品中抗原成分進行測定的方法。

2.5 免疫斑點法(Immunodot assay,IDA)這是免疫印跡法的一種改進的方法。將多種親和層析純化的、生化性質(zhì)明確的核抗原平行包被到膜條上作為固相，可用于抗ENA抗體的檢測[18]。

3 自身抗體檢測的質(zhì)量控制

自身抗體檢測的質(zhì)量控制(QuanlityControl,QC)是保證實驗結(jié)果準確性的重要環(huán)節(jié)，同時也是衡量實驗室檢測水平的一個重要指標。由于自身抗體檢測多為定性實驗或半定量實驗(以滴度報告)，特別強調(diào)每次實驗中應(yīng)同時設(shè)置檢測陽性對照，陰性對照，以監(jiān)測結(jié)果的準確性。同時，也便于對實驗室內(nèi)部、實驗室之間質(zhì)量控制的可比性、重復(fù)性進行評估。

3.1 自身抗體檢測的器材的要求(1)實驗室應(yīng)有充分的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備；設(shè)施和設(shè)備配備合理，能滿足自身抗體檢測的要求。(2)微量加樣器必須定期進行校準，從而使其保持有足夠的準確度和精密度。(3)熒光顯微鏡的質(zhì)量和熒光光源的強度是保證良好分辨率的基礎(chǔ)。(4)酶標儀應(yīng)定期校準，制定標準操作程序和嚴格的維護保養(yǎng)措施。(5)檢測用試劑盒必須由具有相關(guān)資質(zhì)的廠家提供，并按規(guī)定保存。(6)每家開展檢測的實驗室都應(yīng)對廠家推薦的熒光標記物的稀釋方法進行評價，應(yīng)用已知滴度的陽性血清去滴定標記物，以建立操作過程中的正確稀釋方法。(7)質(zhì)控品應(yīng)與患者標本在同樣條件下進行測定，并要特別注意質(zhì)控品的保存條件和保質(zhì)期，不得使用保存不當和超過保質(zhì)期的質(zhì)控品。(8)每家開展檢測的實驗室都應(yīng)建立其自身抗體檢測項目的標準操作規(guī)程文件。(9)相對固定檢測人員，并嚴格按照SOP文件要求進行檢測。陽性結(jié)果最好與該患者過去檢測檔案進行復(fù)核后再發(fā)出結(jié)果。(10)開展自身抗體檢測的實驗室在保證室內(nèi)質(zhì)控的同時，應(yīng)參加國家或國際權(quán)威組織的室間質(zhì)量評價。

3.2 實驗基質(zhì)的選擇要求

3.2.1 實驗基質(zhì)的選擇實驗基質(zhì)的質(zhì)量在很大程度上取決于間接免疫熒光法對自身抗體進行測定的效果。自身抗體檢測中的實驗基質(zhì)，一般用動物或人類的細胞或組織，須經(jīng)一系列方法進行處理，如HEP-2細胞的培養(yǎng)、吸附和固定，冰凍組織切片的制備、貼片等。越來越多的實驗室已經(jīng)使用商品化的自身抗體間接免疫熒光檢測試劑盒。由于生產(chǎn)工藝先進，質(zhì)控措施嚴格，從而保證了實驗結(jié)果準確的可信性。檢測不同的自身抗體應(yīng)選擇不同來源的實驗基質(zhì)，如檢測ANA一般用人上皮HEP-2細胞和靈長類動物肝臟。而器官和組織特異性自身抗體則選用相應(yīng)的抗原器官組織。

3.2.2 熒光標記二抗的選擇在自身抗體檢測中，熒光標記二抗的質(zhì)量直接影響實驗的結(jié)果。熒光素與第二抗體的偶聯(lián)需要保持一定的摩爾比值(F/ P,熒光素/抗體蛋白比值)，F(xiàn)/P值過高將產(chǎn)生明顯的非特異性熒光。

3.3 結(jié)果的判斷和解釋

3.3.1 結(jié)果的判斷實驗條件及檢測試劑盒在規(guī)定條件下，待檢血清在合適的起始稀釋度下，實驗基質(zhì)沒有可辨認的熒光染色模式時，即與陰性對照比較在同一水平，判為陰性；實驗基質(zhì)產(chǎn)生可辨認的特異性熒光染色模式時，即可于陽性對照比較在同一水平或高于陽性對照的水平，判為陽性。通過自身抗體效價與滴度消長，可判斷疾病的活動性，觀察治療反應(yīng)，指導(dǎo)臨床治療。檢驗報告中必須描述每個圖型及其滴度；有的圖型與疾病有相關(guān)性，也可提示做特異性免疫檢測。

3.3.2 結(jié)果解釋應(yīng)結(jié)合相應(yīng)的熒光模式、自身抗體水平、患者年齡等幾方面進行綜合分析。正常老年人，尤其是女性可出現(xiàn)低滴度的自身抗體(1:80)；相反,年齡較小的患者當其滴度在1:40時也應(yīng)進一步篩查(尤其是女性患者)；但一些無癥狀患者也可出現(xiàn)自身抗體的低滴度陽性。因此，有些自身抗

體檢測的結(jié)果必須根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)進行分析[19]。如遇到圖型不典型、意義不明確，也應(yīng)在檢驗報告中有注解，以便臨床醫(yī)師知曉；檢驗報告應(yīng)由資深人員出具；各實驗室應(yīng)建立自己的參考區(qū)間。

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萬本愿，男，1954年生，本科，主任技師，主要研究方向為臨床化學(xué)、分子生物學(xué)及實驗室質(zhì)量管理。