劉文文， 李文學

中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京100081

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子研究進展

劉文文， 李文學*

中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京100081

bHLH（basic helix-loop-helix protein）是真核生物中存在最廣泛的一大類轉(zhuǎn)錄因子，其通過特定的氨基酸殘基與靶基因相互作用，進而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。系統(tǒng)發(fā)育分析表明植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子為單源進化。bHLH轉(zhuǎn)錄因子不僅對于植物的正常生長和發(fā)育必不可缺，同時參與植物適應(yīng)多種逆境脅迫的反應(yīng)過程。然而，由于植物bHLH家族成員眾多、參與的生物過程復雜，對于其了解還不是十分清楚。本文針對植物bHLH的進化、結(jié)構(gòu)特點、生物功能，尤其是在適應(yīng)逆境脅迫中作用等的最新研究結(jié)果進行綜述，以期為進一步深入了解植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能提供理論參考。

bHLH；結(jié)構(gòu)特點；生物學功能

bHLH轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物。自bHLH發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的研究表明該轉(zhuǎn)錄因子對于真核生物的正常生長及發(fā)育必不可缺。在酵母等單細胞真核生物中，bHLH參與染色體的分離、新陳代謝調(diào)節(jié)等過程［1］；在動物中，bHLH主要與感知外界環(huán)境、調(diào)節(jié)細胞周期、組織分化等相關(guān)［2～4］。植物中bHLH家族成員數(shù)量眾多，僅次于MYB類轉(zhuǎn)錄因子，譬如在擬南芥中有超過140個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，水稻中則超過160個。家族的龐大不可避免的造成功能冗余，使研究單個bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能相對困難。本文擬對有限的植物bHLH家族研究結(jié)果，尤其是參與植物適應(yīng)逆境脅迫過程中的作用進行綜述，以期為進一步深入了解植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能的提供理論參考。

1 植物bHLH的結(jié)構(gòu)特點、家族分類及進化

1.1 bHLH的基本結(jié)構(gòu)

bHLH轉(zhuǎn)錄因子因含有bHLH結(jié)構(gòu)域而得名。bHLH結(jié)構(gòu)域由50～60個氨基酸組成，可分為長度為10～15個氨基酸的堿性氨基酸區(qū)和40個氨基酸左右的α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)（HLH區(qū)）。堿性氨基酸區(qū)位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N-端，具有DNA識別和結(jié)合位點。植物中50%以上的堿性氨基酸區(qū)含有高度保守的H5-E9-R13序列（His5-Glu9-Arg13），其對bHLH和靶標DNA的結(jié)合必不可缺［2，5］?；騿幼訁^(qū)上游通常存在E-box結(jié)構(gòu)，是一種有6個堿基（CANNTG）排列的特殊回文序列，能夠被轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)識別并結(jié)合，進而激發(fā)基因進行轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子都能夠識別E-box，而在線蟲體內(nèi)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子還可以與非典型E-box短核苷酸（例如CACGCG和CATGCG）序列結(jié)合［6］。HLH區(qū)中有兩個相連的螺旋結(jié)構(gòu)，多由疏水氨基酸組成，其中23位與64位的亮氨酸（Leu23／64）、54位的亮氨酸或異亮氨基酸（Leu／Iso54）、61位的纈氨酸（Val61）在植物bHLH中高度保守，HLH區(qū)中Leu23、Leu52殘基對于二聚體的形成是必須的［7，8］。

通常，除了bHLH結(jié)構(gòu)域之外，bHLH還具有保守性相對較低的結(jié)構(gòu)域，存在于進化關(guān)系上相近或功能類似的家族中。譬如，動物bHLH轉(zhuǎn)錄因子中存在由6個亮氨酸組成的亮氨酸拉鏈基序（ZIP），該序列與HLH區(qū)中的第二個螺旋相鄰，可通過與第二個螺旋的相互作用影響bHLH轉(zhuǎn)錄因子的空間結(jié)構(gòu)，進而阻止bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體［9］。

1.2 bHLH家族分類、進化關(guān)系及結(jié)構(gòu)特點

依據(jù)進化關(guān)系、與DNA的結(jié)合模式，動物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子被分為A～F六個家族［10］。根據(jù)動物的分類標準，考慮到在特定位置氨基酸的保守性及其有無除bHLH功能域之外的其他保守功能域等條件，Heim等［11］將在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的133個基因劃分為12個家族；隨后又有14個新的bHLH轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)，并被進一步被分為21個家族［2］；但是這種分類方法僅局限于高等陸生植物。隨著該家族成員在苔蘚、海藻等物種中被更多的發(fā)現(xiàn)與鑒定，bHLH轉(zhuǎn)錄因子被細分為32個家族［7］。

動物A家族成員大都可以與CAGCTG或CACCTG類型的E-box結(jié)合，并且此類蛋白質(zhì)的第8位多為精氨酸；B類的第5位則多為賴氨酸或組氨酸，第23位多為精氨酸，能夠與CACGTG或CATGTTG類型的E-box結(jié)合。植物中53% bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點與動物的B類相符，符合H5-E9-R13結(jié)構(gòu)特點；8%與動物A類結(jié)構(gòu)特點相符，含有R8-E9結(jié)構(gòu)［12］，表明大部分植物bHLH同樣能與E-box結(jié)合。在167個水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子中，有141個成員具有與DNA結(jié)合的能力，其中95個是與G-box（E-box的一種）結(jié)合的，19個與其他種類E-box結(jié)合，27個與非E-box DNA結(jié)合；擬南芥的147個bHLH轉(zhuǎn)錄因子中有89個與G-box結(jié)合，20個與其他種類E-box結(jié)合［13］。動物E類bHLH除了具有H5-E9-R13的結(jié)構(gòu)特點外，第6位為保守的脯氨酸，主要與N-box（CACGCG或CACGAG）結(jié)合；C類、F類bHLH中具有的PAS和COE保守域，這幾類bHLH在植物中尚未發(fā)現(xiàn)；同時植物中有11%的bHLH轉(zhuǎn)錄因子含有Q5-A9-R13，為植物所特有。

Nuno等［12］證實大多數(shù)植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在4億4300萬年前的陸生植物中已經(jīng)存在。盡管有一定數(shù)量的基因在不同植物家系中發(fā)生了復制或丟失，但是這些家族成員在植物進化過程中仍高度保守。大約80%植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子在bHLH功能域上具有內(nèi)含子，盡管這些內(nèi)含子的數(shù)量不同，但是位置十分保守［13，14］。通過內(nèi)含子模式分析，推測植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子多為單源進化，與其他真核生物bHLH之間不存在明確的進化關(guān)系。

1.3 植物bHLH二聚體

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要通過同源或者異源二聚體的形式發(fā)揮作用，但其中的機制尚不清楚。現(xiàn)在普遍認為HLH功能域的疏水氨基酸殘基界面特性、帶電荷氨基酸殘基間的相互作用及其分子伴侶蛋白的有效性決定了bHLH轉(zhuǎn)錄因子同源或者異源二聚體的特性［15］。有證據(jù)表明PIF3和HFR1相互作用形成異源二聚體，不僅能夠阻止PIF3與E-box的結(jié)合，而且能與光敏色素形成具有功能的三元復合體［8］。植物中研究最為清楚的當屬bHLH轉(zhuǎn)錄因子與MYB轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。植物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有［DE］Lx2［RK］x3Lx6Lx3R結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)決定了bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間、bHLH與MYB轉(zhuǎn)錄因子相互作用的特異性和穩(wěn)定性［16］。此結(jié)構(gòu)在被子植物和裸子植物中相對保守，表明MYB-bHLH的相互作用在進化上形成時間較早［17］。植物中bHLH能與其他蛋白形成二聚體的特性拓展了bHLH作為轉(zhuǎn)錄因子進行調(diào)節(jié)的范圍。

2 植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能

2.1 bHLH參與植物生長發(fā)育

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子既可以作為轉(zhuǎn)錄激活子又能作為轉(zhuǎn)錄抑制子發(fā)揮生物學作用，并且作用方式多種多樣。Heisler等［18］通過基因功能缺失突變株的結(jié)果證實SPATULA基因可促進花形態(tài)的建成，進一步的研究表明SPATULA也可作為一種光穩(wěn)定型轉(zhuǎn)錄抑制子抑制種子的萌發(fā)，尤其在低溫等逆境脅迫條件下表現(xiàn)的更為明顯［19］。ICE1作為一個典型的組成型bHLH轉(zhuǎn)錄因子，通過與MUTE、FAMA和SPCH等的相互作用控制氣孔細胞分化及保衛(wèi)細胞的形成［20］，盡管單子葉和雙子葉植物在氣孔的發(fā)生、形態(tài)等方面存在差異，但是在玉米和水稻中均存在ICE1的同源基因［21］，暗示bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控氣孔發(fā)育過程中的普在性。與SPATULA、ICE1的組成型表達不同，植物中大多數(shù)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有組織與時空特異性，譬如ZmR和ZmB1分別在玉米籽粒的糊粉層和綠色組織中特異表達，表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要在特定的發(fā)育階段起作用。

2.2 bHLH參與植物適應(yīng)缺鐵脅迫反應(yīng)

盡管bHLH調(diào)控植物體內(nèi)諸多的生化進程，但是有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與植物非生物脅迫反應(yīng)的報道還較少，已有的研究主要集中在適應(yīng)缺鐵、溫度、高鹽、干旱等逆境過程。番茄中的FER基因是植物中第一個被克隆的調(diào)控植物適應(yīng)缺鐵脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，其屬于bHLH家族，主要在根的表皮細胞、薄壁細胞中表達［22］。fer突變體在低鐵環(huán)境下，檢測不到鐵還原酶基因LeFRO1的表達，而且二價鐵吸收基因LeIRT1的表達也顯著降低，出現(xiàn)嚴重黃化現(xiàn)象［22］。通過同源克隆的方法在擬南芥中獲得了AtFIT1。AtFIT1與LeFER在氨基酸水平上有72%的相似性，尤其是在bHLH區(qū)，二者的序列基本一致。與fer突變體相同，fit突變體同樣不能啟動植物缺鐵反應(yīng)機制，體內(nèi)鐵含量顯著下降，表現(xiàn)出嚴重黃化現(xiàn)象［23］。BHLH38、BHLH39、BHLH100以及BHLH101也參與植物適應(yīng)缺鐵脅迫反應(yīng)過程［24，25］。BHLH38和BHLH39可以與FIT1形成異源二聚體，將BHLH38或者BHLH39與FIT1在擬南芥中同時過量表達，轉(zhuǎn)基因植株中FRO2和IRT1持續(xù)高表達，與缺鐵與否無關(guān)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株可以積累更多的鐵［25］，表明FIT1與BHLH38或者BHLH39共同作用調(diào)控植物適應(yīng)缺鐵脅迫反應(yīng)。

2.3 bHLH參與植物適應(yīng)其他非生物脅迫逆境反應(yīng)

ICE1除在植物氣孔形態(tài)建成中起到重要作用外，還能特異性結(jié)合CBF啟動子堿基序列調(diào)節(jié)CBF的表達，CBF轉(zhuǎn)錄因子進而通過調(diào)節(jié)下游與耐受冷脅迫相關(guān)基因表達來提高植物的抗低溫脅迫的能力［26］；PIF4作為一種bHLH家族植物色素相互作用蛋白因子，不僅參與植物提光敏信號的傳遞過程，同時通過與FT基因的互作控制溫度感應(yīng)的開花行為［27］，通過與BZR1基因的相互作用參與環(huán)境、油菜素內(nèi)酯互作調(diào)控植物的生長發(fā)育進程［28］；bHLH92的表達受鹽、干旱、滲透、冷等多種脅迫的強烈誘導，基因敲除突變株對滲透脅迫超敏感，高鹽處理條件下電解質(zhì)滲透物顯著增加，而過量表達bHLH92的轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出較強的抗鹽脅迫的能力［29］。Kim等［30］研究指出，AtNIG1是擬南芥中鈣離子結(jié)合bHLH轉(zhuǎn)錄因子，能與很多鹽響應(yīng)相關(guān)基因的上游啟動子結(jié)合，從而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽能力，該轉(zhuǎn)錄因子在鹽信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用。從陸地棉中分離得到的GhbHLH1轉(zhuǎn)錄因子，則可被ABA、干旱、鹽脅迫所誘導表達［31］。Li等［32］從水稻中分離的OrbHLH001，是一種類ICE1的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，過表達該基因的擬南芥抗鹽及抗凍能力均得到提高，但OrbHLH001的功能與ICE1并不相同，而是不依賴于CBF／DREB1的獨立路徑。現(xiàn)在普遍的觀點認為，bHLH轉(zhuǎn)錄因子處于植物適應(yīng)逆境脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中較為下游的位置，直接調(diào)節(jié)逆境脅迫響應(yīng)基因，調(diào)節(jié)方式更為具體和精細。

3 植物bHLH研究中存在的問題及展望

近年的研究雖然在認識植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)、家族分類、起源與功能方面取得了很大的進展，但由于植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多、功能多樣、作用方式復雜，要全面認識植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族還有很多工作要做：

①植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的分類研究。已有的結(jié)果表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子為單源進化，現(xiàn)有的分類主要參考動物中的分列標準。目前有關(guān)植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能還不十分透徹，不能根據(jù)具體功能對植物bHLH家族進行分類，這需要加強對植物單個bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能研究。

②植物bHLH結(jié)構(gòu)、作用機制的研究。植物bHLH是一類非常古老的基因，除了具有bHLH功能域外，還有很多其他功能未知的結(jié)構(gòu)，對于這些功能未知結(jié)構(gòu)的研究將有助于加深人們對于bHLH的了解。此外，盡管對于很多植物bHLH結(jié)合的靶DNA進行了預測和分析，并提出植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子多可結(jié)合E-box，但是僅對一小部分bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行了驗證，大規(guī)模的作用機制驗證還需開展。

由于bHLH的作用機制多種多樣，對于家族中具體成員功能機制研究并不多，這就需要更多的科研工作者更加深入的研究，隨著生物技術(shù)的不斷革新，植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的神秘面紗也將逐漸被人類揭開。

［1］ Robinson K A， Lopes J M. Survey and summary：Saccharomyces cerevisiae basic helix-loop-helix proteins regulate diverse biological processes［J］.Nucleic Acids Res.，2000，28：1499-1505.

［2］ Atchley W R，F(xiàn)itch W M.A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：5172-5176.

［3］ Amoutzias G D，Robertson D L，Oliver S G，et al..Convergent evolution of gene networks by single-gene duplications in higher eukaryotes［J］.EMBO Rep.，2004，5：274-279.

［4］ Stevens JD，Roalson E H，Skinner M K.Phylogenetic and expression analysis of the basic helix-loop-helix transcription factor gene family：genomic approach to cellular differentiation［J］.Differentiation，2008，76：1006-1022.

［5］ Pires N，Dolan L.Origin and diversification of basic-helixloop-helix proteins in plants［J］.Mol.Biol.Evol.，2010，27：862-874.

［6］ Grove C A，De Masi F，Barrasa M I，et al..A multiparameter network reveals extensive divergence between C.elegans bHLH transcription factors［J］.Cell，2009，138：314 -327.

［7］ Carretero-Paulet L，Galstyan A，Roig-Villanova I，et al..Genome-wide classification and evolutionary analysis of the bHLH family of transcription factors in Arabidopsis，poplar，rice，moss，and algae［J］.Plant Physiol.，2010，153：1398 -1412.

［8］ Brownlie P，Ceska T，Lamers M，et al..The crystal structure of an intact human Max-DNA complex：new insights into mechanisms of transcriptional control［J］.Structure，1997，5：509-520.

［9］ Lupas A.Coiled coils：new structures and new functions［J］.Trends Biochem.Sci.，1996，21：375-382.

［10］ Atchley W R，F(xiàn)itch W M.A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：5172-5176.

［11］ Heim M A，Jakoby M，Werber M，et al..The basic helixloop-helix transcription factor family in plants：a genome-wide study of protein structure and functional diversity［J］.Mol.Biol.Evol.，2003，20：735-747.

［12］ Nuno P，Liam D.Origin and diversification of basic-helix-loophelix proteins in plants［J］.Mol.Biol.Evol.，2010，27：862 -874.

［13］ Li X，Duan X，Jiang H，et al..Genome-wide analysis of basic／helix-loop-helix transcription factor family in rice and Arabidopsis［J］.Plant Physiol.，2006，141：1167-1184.

［14］ Toledo-Ortiz G，Huq E，Quail PH.The Arabidopsis basic／helix-loop-helix transcription factor family［J］.Plant Cell，2003，15：1749-1770.

［15］ Ciarapica R，Rosati J， Cesareni G， et al.. Molecular recognition in helix-loop-helix and helix-loop-helix leucine zipper domains［J］.J.Biol.Chem.，2003，278：12182 -12190.

［16］ Feller A，Machemer K，Braun E L，et al..Evolutionary and comparative analysis of MYB and bHLH plant transcription factors［J］.Plant J.，2011，66：94-116.

［17］ Bedon F，Grima-Pettenati J，Mackay J.Conifer R2R3-MYB transcription factors：sequence analyses and gene expression in wood-forming tissues of white spruce（Picea glauca）［J］.BMC Plant Biol.，2007，7：17.

［18］ Heisler M G，Atkinson A，Bylstra Y H，et al..SPATULA，a gene that controls development of carpel margin tissues in Arabidopsis，encodes a bHLH protein［J］.Development，2001，128：1089-1098.

［19］ Penfield S，Josse EM，Kannangara R，et al..Cold and light control seed germination through the bHLH transcription factor SPATULA［J］.Curr.Biol.，2005，15：1998-2006.

［20］ MacAlister C A，Ohashi-Ito K，Bergmann D C.Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage［J］.Nature，2007，445：537-540.

［21］ Liu T，Ohashi-Ito K，Bergmann D C.Orthologs of Arabidopsis thaliana stomatal bHLH genes and regulation of stomatal development in grasses［J］.Development，2009，136：2265-2276.

［22］ Ling H Q，Bauer P，Bereczky Z，et al..The tomato fer gene encoding a bHLH protein controls iron-uptake responses in roots［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99：13938 -13943.

［23］ Colangelo E P，Guerinot M L.The essential basic helix-loophelix protein FIT is required for the iron deficiency response［J］.Plant Cell，2004，16：3400-3412.

［24］ Wang H Y，Klatte M，Jakoby M，et al..Iron deficiencymediated stress regulation of four subgroup Ib bHLH genes inArabidopsis thaliana［J］.Planta，2007，226：897-908.

［25］ Yuan Y，Wu H，Wang N，et al..FIT interacts with AtbHLH38 and AtbHLH39 in regulating iron uptake gene expression for iron homeostasis in Arabidopsis［J］.Cell Res.，2008，18：385-397.

［26］ Chinnusamy V，Ohta M，Kanrar S，et al..ICE1：a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis［J］.Genes Dev.，2003，17：1043-1054.

［27］ Kumar SV，Lucyshyn D，Jaeger K E，et al..Transcription factor PIF4 controls the thermosensory activation of flowering［J］.Nature，2012，484：242-245.

［28］ Oh E，Zhu JY，Wang Z Y.Interaction between BZR1 and PIF4 integrates brassinosteroid and environmental responses［J］.Nat.Cell Biol.，2012，14：802-809.

［29］ Jiang Y Q，Yang B，Deyholos M K.Functional characterization of the Arabidopsis bHLH92 transcription factor in abiotic stress［J］.Mol.Genet.Genomics，2009，282：503-516.

［30］ Meng CM，Zhang T Z，Guo W Z.Molecular cloning and characterization of a novel Gossypium hirsutum L.bHLH gene in response to ABA and drought stresses［J］.Plant Mol.Biol.Rep.，2009，27：381-387.

［31］ Hernandez JM，Heine G F，Irani N G，et al..Different mechanisms participate in the R-dependent activity of the R2R3／MYB transcription factor C1［J］.J.Biol.Chem.，2004，279：48205-48213.

［32］ Li F，Guo S Y，Zhao Y，et al..Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene（OrbHLH001）from Dongxiang wild rice confers freezing and salt tolerance in transgenic Arabidopsis［J］.Plant Cell Rep.，2010，29：977-986.

Progress of Plant bHLH Transcription Factor

LIUWen-wen，LIWen-xue*
Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China

Basic helix-loop-helix proteins（bHLHs）are found throughout the eukaryotic kingdom，and constitute one of the largest families of plant transcription factors.They can regulate gene expression through interaction with specific motif in target genes.Phylogenetic analysis indicates that plant bHLHs are monophyletic.bHLHs are necessary for plant normal growth and development，and play important roles in abiotic-stress responses.However，we know little about their origins，structures，and functions due to the large quantities and complexity of plant bHLH family.This paper reviews on the evolution，structure characteristics，biological function of plant bHLHs，especially their functions in adapting to abiotic-stress tolerance，so as to provide a theoretical reference for further research on the function of plant bHLH transcription factors.

bHLHs；structural features；biological function

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.02

2012-12-12；接受日期：2012-12-31

國家自然科學基因項目（30970221）資助。

劉文文，碩士研究生，研究方向為玉米氮利用效率生理學及擬南芥抗逆作用機制。*通訊作者：李文學，研究員，博士，主要從事小RNA功能及植物抗逆機制研究。E-mail：liwenxue＠caas.cn