梁 雪，楊越冬，杜 彬，王同坤

（河北科技師范學院，河北省板栗工程技術(shù)研究中心，河北 秦皇島 066004）

板栗Castanea mollissimaBlume屬山毛櫸科（亦名殼斗科）Fagaceae栗屬Castanea[1]植物。栗屬植物是世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟作物，多種植于山坡地，在亞洲、歐洲、美洲有廣泛分布，國外稱之為“健康食品”，為健胃補腎、延年益壽的上等果品[2]。板栗果實中的很多化學成分既有營養(yǎng)價值，又有保健治療作用。板栗富含淀粉和多糖，其中多糖具有一定的活性功能，已有研究結(jié)果表明，多糖含有降血糖血脂、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用等重要生物活性[3-4]，值得深入研究。目前，關(guān)于多糖類物質(zhì)的提取方法主要局限于傳統(tǒng)的熱水輔助提取等[5-7]，但耗時較長。加壓溶劑萃?。ˋutomated Pressurized Liquid Extraction,APLE）技術(shù)是近年來新推出的樣品前處理技術(shù)，具有節(jié)約萃取溶劑、縮短萃取時間，且能提高提取效率等突出優(yōu)點[8]，但由于所要提取的目標物各具有不同的特點，故需要根據(jù)實際情況設置萃取處理參數(shù)，以便獲得有實用價值的最佳萃取條件。例如，張玉等人[9]研究報道，提取柑橘皮中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件是，以80%（V/V）的乙醇為溶劑，在壓強為10.3 MPa、溫度為70 ℃、時間為10 min、萃取循環(huán)次數(shù)為1 次時可獲得目標物的最大萃取率。宋文斌等人[10]的研究結(jié)果表明,在提取人參中的多種人參皂甙時，萃取參數(shù)設置為壓強10 MPa、溫度140℃、時間為5 min、萃取循環(huán)次數(shù)為2次時可獲得最大的萃取量，可比其他常規(guī)方法（浸漬法、超聲波法、勻質(zhì)法、機械振蕩法）高25.88%～58.68%。因此，在針對不同樹種及其不同器官應用加壓溶劑萃取技術(shù)時，均應研究其最佳的萃取條件。文中利用加壓溶劑萃取技術(shù)提取板栗多糖，以萃取溫度、萃取時間、萃取壓力、循環(huán)次數(shù)為考察指標，并用苯酚-硫酸法測定多糖含量[11]，以確定板栗多糖的最佳提取條件。同時與熱水提取、微波提取、酸提取及超聲波提取多糖方法進行了比較[12-15]，以期為板栗有效成分的提取和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料：“燕龍”板栗，采自河北省遷西縣白廟子鄉(xiāng)李興莊優(yōu)種板栗示范采穗園。

主要試劑：葡萄糖標準品、無水乙醇、硫酸、苯酚等試劑均為分析純。

主要設備：APLE-3000全自動加壓溶劑萃取儀（北京吉天儀器有限公司）、Jsp-200 金穗高速多功能粉碎機（浙江省永康市金穗機制造廠）、SJT-Ⅱ多功能恒溫超聲波生物萃取儀（無錫市上佳生物科技有限公司）、G80W23YCSL-Q3格蘭仕微波爐（廣東格蘭仕集團有限公司）、N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)、722S可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 材料預處理

將板栗剝殼后置于鼓風干燥箱中干燥至恒重（25～50 ℃），然后用粉碎機研磨成粉狀，過40目篩，然后裝入密封袋放入干燥器中備用。

1.2.2 APLE提取板栗多糖的工藝流程

稱取一定量板栗粉，與硅藻土充分混合，裝入萃取池，再用硅藻土填滿萃取池，設計不同萃取溫度、靜態(tài)萃取時間、萃取壓力和萃取循環(huán)次數(shù)，開始快速萃取。萃取完成后，取出收集瓶，測量萃取液體積，計算多糖提取率，再對板栗多糖的提取液進行離心、沉淀，得到板栗粗多糖。

1.2.3 熱水輔助提取板栗多糖

稱取一定量的板栗粉，按照1∶35的料液比、提取溫度65 ℃、提取時間1 h的最佳提取條件進行水浴鍋浸提，離心合并上清液，測量上清液體積，計算多糖提取率，再對板栗多糖的提取液進行濃縮、沉淀，得到板栗粗多糖[13]。

1.2.4 微波輔助提取板栗多糖

稱取一定量的板栗粉，按照1∶30的料液比、提取時間50 s，提取功率800 w的最佳提取條件在微波爐內(nèi)提取，離心合并上清液，測量上清液體積，計算多糖提取率，再對板栗多糖的提取液進行濃縮、沉淀，得到板栗粗多糖[13]。

1.2.5 酸輔助提取板栗多糖

稱取一定量的板栗粉，按照提取時間40 min、提取溫度70 ℃、鹽酸濃度0.72 mol/L、料液比為1∶20的最佳提取條件，在水浴鍋內(nèi)浸提，離心合并上清液，測量上清液體積，計算多糖提取率，再對板栗多糖的提取液進行濃縮、沉淀，得到板栗粗多糖[13]。

1.2.6 超聲波輔助提取板栗多糖

稱取一定量的板栗粉，按照浸提溫度30 ℃，超聲波功率870 W，超聲時間50 min，料液比為1∶40的最佳提取條件，用超聲波生物萃取儀提取，離心合并上清液，測量上清液體積，計算多糖提取率，再對板栗多糖的提取液進行濃縮、沉淀，得到板栗粗多糖[13]。

1.2.7 板栗多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。標準曲線的制作過程如下：稱取葡萄糖1.00 g，制得100 μg/mL標準葡萄糖溶液。分別吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于 試 管，以去離子水定容至1.0 mL，即得到不同濃度葡萄糖標準溶液（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL），加入5%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，室溫靜置30 min，以不加葡萄糖標準溶液的溶液作為空白對照，用紫外分光光度計在490 nm處測定其吸光值。以橫坐標為多糖濃度，縱坐標為光密度值，繪制標準曲線（見圖1）。

將板栗多糖液稀釋為合適的倍數(shù)，取稀釋液1.0 mL，按照上述步驟操作，測定吸光值，根據(jù)圖1中葡萄糖標準曲線方程y=7.758 2x－0.003 5計算出多糖的濃度C；并按下式計算多糖的提取率[16]：

上式中，Y表示多糖提取率（%），C表示由標準曲線計算得到的多糖質(zhì)量濃度(μg/mL) ，V表示樣品溶液體積(mL)，M表示板栗粉總質(zhì)量（g）。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2 結(jié)果與分析

2.1 加壓溶劑萃取板栗多糖的單因素試驗

萃取溫度的確定：設置萃取溫度分別為50、55、60、65、70 ℃，試驗結(jié)果如圖2。隨著提取溫度的升高，板栗中多糖的提取率明顯增大，當提取溫度升高到65 ℃時，即達到了最佳萃取溫度；當提取溫度超過65 ℃以后，多糖提取率又開始下降。因此，選定的正交試驗溫度分別為60、65、70 ℃。

圖2 溫度對板栗提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide yield in Chinese chestnut

靜態(tài)萃取時間的確定：設置靜態(tài)萃取時間分別為4、8、12、16、20 min，試驗結(jié)果如圖3。隨著萃取時間的增加，板栗中多糖的提取率逐漸下降，可能由于時間過長導致了多糖的降解。因此，為了提高多糖提取率，選定的正交試驗時間分別為 4、8、12 min。

萃取壓力的確定：設置壓力分別為3、6、9、12、15 MPa，試驗結(jié)果如圖4。隨著壓力的增大，板栗多糖的提取率也跟著增大；當萃取壓力到達6 MPa時，提取率最大；繼續(xù)增大壓力，多糖的提取率開始下降。因此，選定的正交試驗壓力條件分別為3、6、9 MPa。

圖3 時間對板栗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of time on polysaccharide yield in Chinese chestnut

圖4 萃取壓力對板栗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of pressure on polysaccharide yield in Chinese chestnut

循環(huán)次數(shù)的確定：設置循環(huán)次數(shù)分別為1、2、3、4、5次，試驗結(jié)果如圖5。隨著提取次數(shù)的增多，多糖提取率逐漸增大，當提取次數(shù)為3時，提取率達到最大值；隨后多糖的提取率又出現(xiàn)下降的趨勢。由此確定，正交試驗中循環(huán)次數(shù)分別為2、3、4次。

圖5 循環(huán)次數(shù)對板栗提取率的影響Fig.5 Effect of cycle times on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.2 加壓溶劑萃取板栗多糖最優(yōu)條件的確定

根據(jù)單因素試驗所確定的因素水平，設計了4因素3水平L9(34)的正交試驗，得到了板栗多糖加壓溶劑萃取的最佳工藝條件（如表1所示）。

表1 正交試驗設計的因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experimental design

本研究即按照此設計條件進行正交試驗，結(jié)果如表2所示。4個因素對板栗多糖提取率的影響的主次順序為提取時間＞循環(huán)次數(shù)＞提取壓力＞提取溫度。根據(jù)顯著性檢驗確定的最佳提取工藝條件為A3B2C2D1，即提取溫度為70 ℃，提取時間為8 min，萃取壓力為6 MPa，循環(huán)次數(shù)為2次。

表2 板栗多糖提取正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of polysaccharide extraction in Chinese chestnut

正交處理后，對試驗數(shù)據(jù)進行了方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，萃取時間、循環(huán)次數(shù)、萃取壓力對多糖提取率的影響極顯著，萃取溫度對多糖提取率的影響不顯著。

2.3 驗證性試驗結(jié)果

為了驗證試驗結(jié)果的可靠性，根據(jù)最佳提取條件進行了驗證性試驗。在萃取溫度為70 ℃，萃取時間為8 min，萃取壓力為6 MPa，循環(huán)次數(shù)為2次的條件下，板栗多糖的實際提取率為20.14%±0.025 4%。因此認為，對板栗多糖提取條件的優(yōu)化是可行的，具有實際應用價值。

表3 方差分析結(jié)果?Table 3 Result of variance analysis

2.4 5種板栗多糖提取方法的比較

根據(jù)正交試驗所確定的加壓溶劑萃取板栗多糖的最優(yōu)條件進行多糖提取，結(jié)果得出板栗多糖的提取率為20.14%。同時，根據(jù)參考文獻介紹的熱水輔助提取、微波輔助提取、酸輔助提取和超聲波輔助提取板栗多糖的最優(yōu)方法進行試驗并計算提取率，所得結(jié)果見表4。

表4 APLE法最優(yōu)多糖萃取條件及其與傳統(tǒng)提取多糖方法的對比Table 4 Comparison of the optimal polysaccharide extraction conditions of pressurized solvent extraction and some traditional polysaccharide extraction methods

將表4中不同提取方法所得的結(jié)果進行比較后可知：加壓溶劑萃取法所用時間短，循環(huán)2次的時間僅有16 min，而其它4種輔助提取法所需時間均長于加壓溶劑萃取法，并且要達到加壓溶劑萃取法相似的提取效果則需12 h左右；此外，加壓溶劑萃取法溶劑使用量少，萃取液體積小，多糖濃度高，省去了真空濃縮步驟，提高了萃取效率，多糖提取率比熱水提取、微波提取、酸提取分別提高了3.20、13.86 、6.50個百分點。加壓溶劑萃取法與超聲波提取相比，雖然提取率降低了2.37個百分點，但是在同等的時間內(nèi)（16 min），超聲波輔助提取的多糖提取率僅為8.72%，遠遠低于加壓溶劑萃取法。

3 結(jié)論與討論

以加壓溶劑萃取法提取板栗中多糖的最佳工藝參數(shù)為：萃取溫度70 ℃，靜態(tài)萃取時間8 min，萃取壓力6 MPa，循環(huán)次數(shù)2 次，多糖的提取率達20.14%。加壓溶劑萃取法與常規(guī)的多糖提取技術(shù)相比，具有4方面的優(yōu)勢：①快速，完成1 次提取一般僅需8 min；萃取時間縮短了，可以保證萃取物熱降解減少；②溶劑用量少，20 g樣品僅需30 mL溶劑，萃取液濃度較高，所得萃取液可直接用于醇沉試驗，省去了真空濃縮步驟；③萃取效率高，顯著降低了單個樣品的提取成本；④使用方便，安全性好，自動化程度高。

采用熱水輔助法、微波輔助法、酸輔助法和超聲波輔助法提取板栗多糖的單因素試驗中，當達到一定提取時間后再繼續(xù)延長提取時間，多糖的提取率會逐漸下降，其原因可能是在較高溫度條件下時間的延長會導致多糖降解，持續(xù)高溫易破壞多糖結(jié)構(gòu)，且影響多糖的品質(zhì)。而加壓溶劑萃取法的最佳萃取溫度為70 ℃，完成1 次提取一般僅需8 min，萃取時間的縮短可保證萃取物熱降解減少，從而提高萃取率，減小對多糖結(jié)構(gòu)和活性的影響。由此可見，用加壓溶劑萃取法提取板栗多糖的提取方法明顯優(yōu)于其它4種提取方法，且加壓溶劑萃取法對多糖品質(zhì)的影響不大，對多糖結(jié)構(gòu)分析和生物活性的影響小，便于在生產(chǎn)中應用，這將對板栗新品種選育和開發(fā)利用及板栗多糖的提取都具有十分重要的意義。

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