徐杰偉 蔣桂星 曹利平

氯化鋰對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖、周期的影響及其作用機(jī)制

徐杰偉 蔣桂星 曹利平

目的 探討氯化鋰對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖、周期的影響及其作用機(jī)制。 方法 應(yīng)用MTT法及DNA PREP細(xì)胞周期法檢測(cè)BEL-7402經(jīng)氯化鋰作用后的增殖及周期改變情況，Western blot檢測(cè)糖原合成激酶-3（GSK-3）、失活pGSK-3及其下游分子CyclinD1的表達(dá)情況。 結(jié)果 氯化鋰可顯著抑制BEL-7402的增殖，并呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性（P＜0.05）；氯化鋰可使BEL-7402的G0/G1期比例明顯降低、G2/M期比例顯著升高（P＜0.05）；氯化鋰作用后GSK-3、失活pGSK-3及CyclinD1蛋白的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。 結(jié)論 氯化鋰可抑制肝癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制GSK-3活性并上調(diào)CyclinD1表達(dá)使肝癌細(xì)胞阻滯于G2/M期。

肝癌 糖原合成激酶-3 氯化鋰 CyclinD1

糖原合成激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是普遍存在于真核細(xì)胞生物中的一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，可參與多種細(xì)胞生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化及存活[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3異常表達(dá)可致腫瘤的發(fā)生。氯化鋰是GSK-3的高度選擇性抑制劑，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、影響癌基因表達(dá)及誘導(dǎo)凋亡的作用[2]。本研究旨在探討氯化鋰對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、周期影響及其對(duì)GSK3、CyclinD1表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝細(xì)胞癌株BEL-7402由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供，氯化鋰、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司；鼠抗人GSK-3α/β單克隆抗體（克隆號(hào)：sc-7291）、兔多抗磷酸化GSK-3（pGSK-3）βser9（克隆號(hào)：sc-11757）、pGSK-3αser21（克隆號(hào)：sc-16308）均購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗人CyclinD1多克隆抗體（克隆號(hào)：2261-1）購(gòu)自EPITMICS公司，βactin一抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記二抗及羊抗鼠IgG-HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，ECL為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品，PVDF膜由Millipore公司生產(chǎn)。蛋白酶抑制劑購(gòu)自Sigma公司，DNA PREP細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)定 BEL-7402細(xì)胞用含10%FBS（青霉素、鏈霉素100U/ml）的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BEL-7402細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后加入濃度梯度（0、5、10、20、40、80mmol/L）PBS溶解的氯化鋰，對(duì)照組加等量PBS，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2.5～4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490nm處吸光度（OD）值。每組取3次實(shí)驗(yàn)平均值，計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率=（1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.2 細(xì)胞周期分析 取10、20nmol/L氯化鋰分別處理BEL-7402細(xì)胞24h及48h，對(duì)照組加等量PBS，收獲細(xì)胞按DNA PREP細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加50μl DNA PREP LPR打孔10min，加500μl DNA PREP Stain室溫避光30min，上流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)DNA含量，應(yīng)用Multicycle for Windows軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.2.3 Western blotting檢測(cè) 取10、20mmol/L氯化鋰處理BEL-7402細(xì)胞后48h收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，制備10%SDS-PAGE凝膠，每孔上樣30μl，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，依次加入β-actin、GSK-3α/β、pGSK-3βser9、pGSK-3αser21、CyclinD1抗體（1∶1 000）4℃過(guò)夜，洗膜后，二抗室溫孵育1h，再洗膜后用適量ECL孵育3min，用 ImageQuant LAS4000mini機(jī)器自動(dòng)顯影，使用Quantity One軟件分析條帶像素值。蛋白相對(duì)表達(dá)量=各個(gè)蛋白的凈像素值/actin的凈像素值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 氯化鋰作用后BEL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化 不同濃度的氯化鋰對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度梯度升高，OD值明顯降低，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也明顯增加，各濃度氯化鋰作用72h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度、不同時(shí)間氯化鋰作用于肝癌細(xì)胞后增殖變化

2.2 氯化鋰作用于BEL-7402細(xì)胞后其細(xì)胞周期變化見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度及不同時(shí)間氯化鋰作用后BEL-7402細(xì)胞周期的變化

由圖2可見(jiàn)，加入10、20mmol/L的氯化鋰分別培養(yǎng)24、48h后，G0/G1期比例低于對(duì)照組，而G2/M期比例顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 氯化鋰作用后GSK-3、pGSK-3βser9、pGSK-3αser21、CyclinD1蛋白的表達(dá)情況 以β-actin為內(nèi)參照，對(duì)照組、氯化鋰10mmol/L及20mmol/L作用48h組總GSK-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為：1.193±0.068、1.361± 0.081、1.822±0.059；pGSK-3βser9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為 1.011±0.057、1.354±0.089、1.828±0.078；pGSK-3αser21蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.706±0.042、0.930±0.065、1.239±0.084；CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.907± 0.014、1.389±0.036、2.644±0.044。與對(duì)照組比較，氯化鋰10mmol/L及20mmol/L作用48h后使總GSK-3、失活GSK-3及CyclinD1均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 氯化鋰作用后相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

早期的研究發(fā)現(xiàn)，氯化鋰可用于治療痛風(fēng)。1949年，澳大利亞學(xué)者Cade首先采用碳酸鋰治療精神性興奮，證明它是預(yù)防或治療躁狂或躁狂憂(yōu)郁性躁狂期的有效藥物[3]。此后大量研究表明，鋰離子可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如在前列腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞等癌細(xì)胞中，氯化鋰能使細(xì)胞阻滯于G2/M期或通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[4-5]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，氯化鋰主要通過(guò)影響GSK-3的活性調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。1996年，Klein等[6]首次報(bào)道了鋰離子可選擇性抑制GSK-3。研究表明，GSK-3在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中其重要調(diào)節(jié)作用，可見(jiàn)氯化鋰發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用可能主要通過(guò)抑制GSK-3活性實(shí)現(xiàn)。

GSK-3是存在于真核細(xì)胞生物中的一種多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶，其在哺乳動(dòng)物中有兩種亞型，包括GSK-3α和GSK-3β，兩者生物學(xué)功能相似。若GSK-3α第21位的絲氨酸和 GSK-3β第9位的絲氨酸被磷酸化，則GSK-3的活性下降。相反，GSK-3α第279位的酪氨酸和 GSK-3β第216位的酪氨酸被磷酸化，則GSK-3的活性增強(qiáng)[7]。GSK-3最初的生物學(xué)作用主要是作為糖代謝調(diào)節(jié)酶參與調(diào)節(jié)糖代謝的功能，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)GSK-3異常激活與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切?；钚訥SK-3能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，應(yīng)用氯化鋰抑制GSK-3活性后可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及存活[8]；此外，抑制GSK-3β活性還可通過(guò)下調(diào)存活蛋白survivin的表達(dá)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。這些研究提示GSK-3是多種腫瘤細(xì)胞增殖和生存的促進(jìn)因子。

目前，GSK-3參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確。由于參與調(diào)節(jié)的底物及信號(hào)通路眾多，其調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制非常復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3可通過(guò)相關(guān)信號(hào)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等影響腫瘤惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)展。如GSK-3是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的關(guān)鍵激酶[10]。NF-κB的異常激活可通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2、IAP等的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡。此外，GSK-3還可調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的CyclinD1蛋白及轉(zhuǎn)錄因子β-catenin等。因此，作為GSK-3的特異性抑制劑，氯化鋰可作為一種非常有用的研究工具用于對(duì)GSK-3β廣泛的生物學(xué)功能研究。

本研究結(jié)果顯示，氯化鋰可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，并呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性，氯化鋰作用后可使肝癌細(xì)胞被阻滯在G2/M期；另外還發(fā)現(xiàn)，氯化鋰作用后總GSK-3、失活GSK-3（pGSK-3βser9、pGSK-3αser21）及Cyclin D1表達(dá)顯著上調(diào)。筆者推測(cè)氯化鋰可能通過(guò)抑制GSK-3活性進(jìn)而上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)使肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。而既往研究表明，Cyclin D1是細(xì)胞周期的正向調(diào)控蛋白，在細(xì)胞周期關(guān)鍵限速點(diǎn)G1-S轉(zhuǎn)換中起重要作用，它能夠促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。但本文結(jié)果顯示，氯化鋰作用后肝癌細(xì)胞周期停滯于G2/M期，因此筆者認(rèn)為，氯化鋰抑制GSK-3活性后，雖然上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，但之后可能使更多的癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，因此G0/G1期比例顯著下降，而G2/M比例升高。但GSK-3如何使肝癌細(xì)胞進(jìn)一步阻滯于G2/M期的具體機(jī)制仍需更深入的研究。

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Effect of lithium chloride on proliferation and cell cycle of human hepatoma cells

XU Jiewei,JIANG Guixing,CAO Liping.
Department of Surgery，the Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310009,China

Objective To investigate the effect of lithium chloride (LiCl)on cell proliferation，cell cycle of human hepatoma cells and its mechanism. Methods Cultured human hepatoma BEL-7402 cells were treated with different concentrations of LiCl. Cell proliferation was measured by MTT assay and cell cycle was examined by DNA PREP cell cycle assay.The expressions of GSK-3,inactivated GSK-3 and CyclinD1 were determined by Western blot. Results LiCl inhibited BEL-7402 cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner.After LiCl treatment the percentage of G0/G1 phase was significantly reduced,the G2/M phase was significantly increased,and the expression levels of GSK-3,inactivated GSK-3 and CyclinD1 were up-regulated. Conclusion LiCl can inhibit the proliferation of BEL-7402 cells,in which inactivation of GSK-3 and up-regulation of CyclinD1 may be involved leading to cell cycle arrest in G2/M phase.

Liver cancer Glycogen synthase kinase 3 Lithium chloride CyclinD1

2013-01-14）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

310009 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肝膽外科

曹利平，E-mail：cao@zju.edu.cn