徐剛 鄒循亮 傅珍春 鄢巨振 尹洪萍 亢曉冬 劉茂林 黃妙珍 項捷高云潔

●論 著

硒對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織結(jié)締組織生長因子表達及腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化的影響

徐剛 鄒循亮 傅珍春 鄢巨振 尹洪萍 亢曉冬 劉茂林 黃妙珍 項捷高云潔

目的 探討硒對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織結(jié)締組織生長因子（CTGF）表達及腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化的影響。方法以單側(cè)輸尿管結(jié)扎致腎間質(zhì)纖維化大鼠模型。將54只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（A組）、單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）組（B組）、UUO+硒組（C組），每組18只。C組給予亞硒酸鈉0.2mg/（kg·d）灌胃。A、B組給予同等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃。術(shù)后第7、14、21天各組隨機處死6只大鼠，腎組織行HE、Masson染色評定腎間質(zhì)纖維化程度，免疫組織化學(xué)半定量法檢測CTGF和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達。Western印跡法檢測腎組織CTGF蛋白表達?；瘜W(xué)比色法檢測腎組織氧化指標谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的表達水平。結(jié)果術(shù)后各時點C組腎間質(zhì)纖維化程度較B組明顯減輕（P＜0.05），腎組織CTGF和α-SMA的表達強度明顯低于B組（P＜0.05或0.01）、GSH-Px和SOD水平明顯高于B組（P＜0.05），MDA含量明顯低于B組（P＜0.05）。B組腎組織中CTGF、a-SMA表達量之間呈正相關(guān)（P＜0.05），CTGF和a-SMA表達量與腎間質(zhì)纖維化病變程度呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論硒可以減輕UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化程度，其機制可能與硒的抗氧化作用、下調(diào)腎組織CTGF的表達、抑制腎小管上皮細胞－肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。

硒 單側(cè)輸尿管梗阻 氧化應(yīng)激 結(jié)締組織生長因子 α-平滑肌肌動蛋白 腎間質(zhì)纖維化

Effect of selenium on expression of connective tissue growth factor and transdifferentiation of renal tubular epithelial cells in unilateralureteral obstruction rats

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of selenium on expression of connective tissue growth factor（CTGF）and transdifferentiation of renal tubular epithelial cells in rat model of unilateral ureteral obstruction(UUO).MethodsFifty four male SD rats were randomly divided into 3 groups:sham-operation group (group A),UUO group (group B),UUO+sodium selenite group (group C)with 18 animals in each group.The unilateral ureteral obstruction was induced by ligation of unilateral ureter in groups B and C.Rats in group C received sodium selenite 0.2mg/(kg-1·d-1)by gastric lavage 1d before operation;same volume of normal saline was administrated in groups A and B.At d7,14 and 21 after the treatment,6 rats from each group were randomly sacrificed.The extent of renal interstitial fibrosis was evaluated by HE and Masson staining of the renal tissue sections.Immunohistochemical method and Western blot were used to examine the expression of CTGF and α-smooth muscle actin(α-SMA). Superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA)and glutathione peroxidase(GSH-px)levels in renal cortex were measured by colorimetric assay.ResultsThe extent of renal interstitial fibrosis and the expression of CTGF and α-SMA in renal cortex were significantly lower in group C at d7,14 and 21 after the operation,compared to those in group B(P＜0.05 or P＜0.01).The contents of SOD and GSH-px in renal cortex of group C were significantly higher than those in group B at d7,14 and 21,respectively(P＜0.05),while the MDA level in renal cortex was significantly decreased(P＜0.05).The expression of CTGF and α-SMA in renal cortex was positively correlated to the extent of renal interstitial fibrosis in group B(r=0.817,P＜0.05;r=0.829,P＜0.05,respectively);and CTGF and α-SMA was positively correlated with each other(r=0.803,P＜0.05).Conclusion Selenium may re-duce the extent of renal fibrosis in rat UUO model,which may be related to anti-oxidant and down-regulation of CTGF and α-SMA expression in renal tissue and inhibition of transdifferentiation of renal tubular epithelial cells.

【 Key words】Selenium Unilateral ureteral obstruction Oxidative stress Connective tissue growth factor(CTGF) α-smooth muscle actin(α-SMA) Renal interstitial fibrosis

腎間質(zhì)纖維化是腎臟疾病的共同終點，而腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化（TEMT）在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1]。研究表明，TGF-β1是誘導(dǎo)TEMT的重要因素[2]，結(jié)締組織生長因子（CTGF）基因轉(zhuǎn)染也能誘導(dǎo)TEMT[3]。CTGF是介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)腎纖維化的下游分子，與腎臟纖維化關(guān)系密切，可作為腎纖維化疾病干預(yù)治療的靶目標。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的過量活性氧（ROS）可通過誘導(dǎo)TGF-β1和CTGF的過度表達，在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展起重要作用[4-6]。因此，抗氧化、抑制腎組織CTGF過表達，抑制TEMT，對防止腎間質(zhì)纖維化，延緩慢性腎臟病的病程進展具有十分重要的意義。微量元素硒是若干抗氧化酶類自由基清除劑如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、磷脂氫GSH-Px（PHGPx）和硒蛋白-P（Se-P）的必需組分，具有肯定的抗氧化作用。其能否通過抗氧化抑制腎組織CTGF過表達，抑制TEMT，進而減輕腎間質(zhì)纖維化，國內(nèi)外鮮見報道。本研究通過建立單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）腎間質(zhì)纖維化模型后進行補硒干預(yù)，觀察補硒前后腎間質(zhì)病變、氧化應(yīng)激指標以及CTGF、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達的變化，旨在探討硒對腎間質(zhì)纖維化的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：選擇6周齡雄性清潔級SD大鼠54只，體重180～200g，由杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[合格證號：syxk（浙2011-0157）]。藥品、試劑及儀器：亞硒酸鈉片[0.2mg/片（按硒計91.3μg），規(guī)格：30片/盒]購于上海天賜福生物工程有限公司；兔抗大鼠CTGF、α-SMA多克隆抗體（1：100，美國Abcam）；二抗為EnVision是標記有辣根過氧化物酶及山羊抗小鼠（或兔）免疫球蛋白的多聚體分子（基因科技上海有限公司）。α-actin單克隆抗體（英國Abcam），BCA蛋白測定試劑盒（美國 Pierce），ECL放光試劑（美國Pierce），Western印跡用PVDF膜（美國Bio-Rad），GSH-px、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程公司）。BioTeK ELX800酶標儀（美國BioTek），Mini-PROTEAN系統(tǒng)及Mini Trans-Blot（美國Bio-Rad），CMIAS系列多功能真彩圖像分析儀（北京航空航天大學(xué)）。

1.2 方法

1.2.1 UUO模型制作 54只SD大鼠實驗期間自由飲水、進食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d無異常后用于制備動物模型。以10%水合氯醛（30mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，備皮、消毒，在無菌條件下行左側(cè)恥骨上切口，逐層打開腹膜后，沿左腎下極尋找并游離左側(cè)輸尿管，在距輸尿管中上1/ 3處用0號絲線結(jié)扎輸尿管，在其遠端0.5cm處再次結(jié)扎輸尿管，然后從中剪斷輸尿管以防逆行性感染。逐層縫合肌層與皮膚關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組同樣開腹，游離輸尿管后即關(guān)腹。

1.2.2 實驗設(shè)計與分組 按數(shù)字隨機表法將54只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（A組）、UUO組（B組）和UUO+硒組（C組），每組18只。C組從術(shù)前1d至處死當(dāng)天，每天給予亞硒酸鈉0.2mg/kg（濃度0.01mg/ml）灌胃。A組和B組給予0.9%氯化鈉溶液（10ml/kg）灌胃。分別于術(shù)后第7、14、21天以10%水合氯醛（30mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后處死大鼠（各組每個時間點隨機處死6只），取術(shù)側(cè)（左側(cè)）腎皮質(zhì)組織（在冰臺操作），分成兩部分，一部分用錫箔紙包裹并標記后迅速置于液氮罐中并保存于-80℃冰箱，用于腎組織勻漿氧化指標（GSH-Px、SOD、MDA）含量分析及蛋白印跡測試；另一部分經(jīng)10%中性福爾馬林固定后用于HE、Masson染色及免疫組化分析。

1.2.3 腎組織形態(tài)學(xué)分析 10%中性福爾馬林固定的腎組織，經(jīng)脫水、透化后石蠟包埋，3μm切片。按常規(guī)方法進行HE、Masson染色后光鏡觀察。在Masson染色組織切片上進行腎間質(zhì)纖維化指數(shù)評分。在CMIAS系列多功能真彩圖像分析儀下計算腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)。每張切片在高倍鏡（×200）下隨機選取10個不重疊視野測定小管間質(zhì)纖維化面積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比，進行半定量評分[7]。間質(zhì)纖維化指數(shù)評分標準如下：0分，腎小管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)無纖維化；1分，間質(zhì)輕度纖維化（以灶性為主，范圍＜25%），腎小管基本正常；2分，間質(zhì)中度纖維化（病灶范圍25%～50%，伴有腎小管萎縮、腎小管基底膜增厚；3分，間質(zhì)彌漫性纖維化（病灶范圍＞50%），伴大量腎小管萎縮、腎小管基底膜增厚。每張切片取10個視野的平均積分，再在各組取平均值。

1.2.4 免疫組化分析 CTGF、α-SMA均采用EnVision二步法。4μm石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用含3%的H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶。用1g/L的胰蛋白酶37℃修復(fù)抗原30min。分別加入CTGF（工作濃度為1∶50）、α-SMA（工作濃度為1∶100），4℃冰箱過夜。PBS洗滌后加En-Vision兔二抗，37℃30min，PBS洗滌后用DAB顯色2～10min，用dd H2O終止顯色，蘇木素復(fù)染1～2min，蘭化，常規(guī)脫水、透明、封片。同時用PBS代替一抗作陰性對照。雙盲法應(yīng)用CMIAS系列多功能真彩圖像分析儀，分別對各組免疫組化結(jié)果進行分析，先在低倍鏡下觀察（每只動物的切片隨機取40個視野，將視野分為上、下、左、右、中），之后取視野的中央在高倍鏡下（×200倍）計算每個視野下陽性染色區(qū)域占總視野面積的百分比，之后取40個視野百分比的均值[8]。

1.2.5 腎組織CTGF蛋白檢測 取適量大鼠腎皮質(zhì)組織，經(jīng)液氮研磨后用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織蛋白并采用BCA法對其進行定量。每個標本取40μg蛋白，按1∶4加入5×loading buffer，煮沸5min后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后采用PVDF膜進行濕法轉(zhuǎn)膜，300mA 2h，之后用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5h。分別采用以下一抗4℃孵育過夜：抗CTGF（工作濃度1∶400）以及內(nèi)參抗-actin（工作濃度1∶800Abcam）。1× TBST液漂洗3遍后室溫孵育二抗（羊抗兔IgG，1∶4 000，Epitomics）1h。漂洗后用ECL試劑（Pierce）顯色并用醫(yī)用膠片顯影。

1.2.6 腎組織氧化損傷指標檢測 采用比色法檢測腎組織勻漿中氧化指標GSH-Px、SOD、MDA的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度的比較 見圖1-2。

圖1 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化染色情況（Masson染色，×200）

圖2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化評分比較

由圖1-2可見，隨梗阻時間延長腎間質(zhì)逐步增寬，腎小管上皮細胞彌漫性空泡變性，腎小管管腔擴大、萎縮，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、水腫和纖維化改變逐步加重。B、C組各時點腎間質(zhì)纖維化指數(shù)均明顯高于A組（均P＜0.01），C組腎間質(zhì)纖維化指數(shù)明顯低于B組（P＜0.05）。

2.2 免疫組化方法檢測腎組織CTGF和α-SMA的表達 見圖3-6。

由圖3-6可見，B、C組各時間點腎組織CTGF和α-SMA的陽性細胞面積百分比均顯著高于A組（均P＜0.01）；C組各時間點腎組織CTGF和α-SMA的陽性細胞面積百分比明顯低于B組（P＜0.05或0.01）。

2.3 Western印跡方法檢測腎組織CTGF的表達 見圖7-8。

由圖7-8可見，B、C組各時間點腎組織CTGF蛋白表達均顯著高于A組（均P＜0.01）；術(shù)后第14、21天時C組各時間點腎組織CTGF蛋白表達明顯低于B組（P＜0.01）。

2.4 各組大鼠腎組織GSH-Px、SOD、MDA變化的比較 見表1。

由表1可見，B組各時間點腎組織GSH-Px及SOD水平均顯著低于A組（均P＜0.01）、MDA水平顯著高于A組（均P＜0.01）；C組各時點腎組織GSH-Px及SOD水平低于A組、MDA水平高于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；C組各時點腎組織GSH-Px及SOD水平均明顯高于B組（均P＜0.05）、MDA水平明顯低于B組（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腎組織CTGF表達情況（免疫組化，×200）

圖4 各組大鼠腎組織CTGF陽性面積百分比的比較

圖5 各組大鼠腎組織α-SMA表達情況（免疫組化，×200）

圖6 各組大鼠腎組織α-SMA陽性面積百分比的比較

圖7 各組大鼠腎組織CTGF蛋白Western印跡檢測情況

圖8 各組大鼠腎組織CTG蛋白表達的比較

表1 各組大鼠腎組織GSH-Px、SOD、MDA變化的比較

2.5 相關(guān)性分析 B組大鼠腎組織CTGF與α-SMA的表達呈正相關(guān)（r=0.803，P＜0.05），CTGF及α-SMA的表達與腎間質(zhì)纖維化病變程度呈正相關(guān)（r=0.817、0.829，均P＜0.05）。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是所有腎臟疾病進展到終末期腎病的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，在人類腎臟疾病的轉(zhuǎn)歸中起著決定性作用。肌成纖維細胞（MF）是合成細胞外基質(zhì)（ECM）的重要細胞，特異性地表達α-SMA，與組織纖維化的形成密切相關(guān)。

研究表明，在腎間質(zhì)纖維化的動物模型中，腎組織中部分MF是由腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化而來，這一過程稱為TEMT[9]，TEMT是腎間質(zhì)纖維化的重要發(fā)病機制之一[1]。CTGF是TGF-β介導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的重要下游效應(yīng)因子，可在TGF-β誘導(dǎo)下，參與間質(zhì)成纖維細胞或腎小管上皮細胞ECM的過量合成，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。有學(xué)者應(yīng)用RT-PCR檢測到TGF-β1可使腎小管上皮細胞CTGF基因表達上調(diào)，而降低CTGF表達可明顯抑制由TGF-β1介導(dǎo)的腎小管上皮細胞向纖維母細胞轉(zhuǎn)化[10]。這提示CTGF過度表達可以誘導(dǎo)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化為MF，促進ECM合成，導(dǎo)致腎臟纖維化。

腎間質(zhì)纖維化的組織學(xué)特征是腎小管的萎縮和ECM過多沉積，目前認為ECM主要由α-SMA陽性的MF產(chǎn)生。越來越多的研究表明，腎小管上皮細胞可轉(zhuǎn)分化為能產(chǎn)生和分泌ECM的MF，而在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生中起重要作用[11-12]；CTGF表達陽性的間質(zhì)細胞可同時表達α-SMA[13]。TGF-β1能上調(diào)CTGF基因的表達，繼而上調(diào)α-SMA基因的表達，用CTGF反義核苷酸干擾能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA的表達。這些研究結(jié)果表明，CTGF可在TGF-β1的下游發(fā)揮作用，促使腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化為MF。提示抑制CTGF的促生長和轉(zhuǎn)分化作用可能是一種抗腎間質(zhì)纖維化的新治療靶點。近期的研究表明，作為細胞信號因子的氧自由基可以介導(dǎo)和放大UUO所致的炎癥損傷、刺激成纖維細胞的增生，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[14]。外源性H2O2在誘導(dǎo)TEMT、基質(zhì)重塑及腎小管間質(zhì)纖維化過程中起重要作用[15]?？寡趸瘧?yīng)激治療能有效減輕腎間質(zhì)纖維化[16]；應(yīng)用CTGF反義寡核苷酸治療可阻斷體外培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細胞CTGF表達，抑制TGF-β1介導(dǎo)的纖連蛋白（FN）和Ⅰ型膠原的合成，并顯著減輕鼠腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[17]。

本研究結(jié)果顯示，與A組比較，B組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度顯著，腎組織CTGF、α-SMA表達顯著增加，CTGF與α-SMA的表達呈正相關(guān)，CTGF和α-SMA表達與腎間質(zhì)纖維化病變程度呈正相關(guān)；腎組織中GSH-Px、SOD水平降低，MDA水平增高；而C組腎間質(zhì)纖維化指數(shù)、腎組織CTGF、α-SMA的表達強度和腎組織MDA水平均明顯低于B組，GSH-Px、SOD水平均明顯高于B組。證實氧化損傷和CTGF、α-SMA表達增強與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切，而補硒干預(yù)后大鼠腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，CTGF和α-SMA表達減少，腎間質(zhì)纖維化程度減輕。提示過強的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能通過上調(diào)腎組織CTGF、α-SMA的表達，引起或加重腎間質(zhì)纖維化；而補硒治療則可能通過其抗氧化作用下調(diào)腎組織CTGF、α-SMA的表達，減輕腎間質(zhì)纖維化。Takeda等[18]研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑鹽酸咪達普利聯(lián)合Rho激酶抑制劑法舒地爾治療可通過抑制腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)、TGF-β/collagen表達、單核/巨噬細胞浸潤、細胞分化及炎癥反應(yīng)，減輕腎間質(zhì)纖維化。

總之，氧化應(yīng)激和氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的過量ROS是腎間質(zhì)纖維化的一個重要促進因素。硒是GSH-Px和PHGPx、Se-P和SOD等抗氧化酶類自由基清除劑的必需組分，具有保護細胞結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物損害和干擾的作用，并能直接清除多種形式的ROS，防止氧化損傷的積累，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。由此可見，通過補充微量元素硒抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少腎組織CTGF的過表達，抑制TEMT，減少ECM的合成可能是延緩或阻止腎間質(zhì)纖維化的另一新的治療靶點，提示補硒治療在防治腎間質(zhì)纖維化中具有潛在的臨床應(yīng)用價值，但其確切作用機制尚待進一步研究。

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2013-02-28）

（本文編輯：歐陽卿）

杭州市科技計劃發(fā)展項目（20080333B19）

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科、杭州師范大學(xué)腎臟病研究所（徐剛、鄒循亮、傅珍春、鄢巨振、劉茂林、黃妙珍、項捷、高云潔）；杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心（尹洪萍、亢曉冬）

徐剛，E-mail:xugang58@Aliyun.com