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超排卵周期中卵泡不同反應組鈣粘素的表達研究

2013-04-18 03:50張崢程張治芬
浙江醫(yī)學 2013年4期
關鍵詞:顆粒細胞卵母細胞雌二醇

張崢程 張治芬

●論 著

超排卵周期中卵泡不同反應組鈣粘素的表達研究

張崢程 張治芬

目的 研究超排卵周期中卵巢不同反應組患者的卵泡液E-cadherin、N-cadherin、雌二醇、孕酮的表達及相互關系。 方法 對70例因輸卵管、男性因素不孕患者行體外受精-胚胎移植,按取卵時卵泡發(fā)育數(shù)目不同分為低反應組、高反應組及正常反應組。用ELISA法及CL法分別測定各組卵泡液中E-cadherin、N-cadherin、雌二醇、孕酮水平,并作比較分析。 結果 高反應組N-cadherin顯著高于正常反應組(P<0.05)。低反應組E-cadherin顯著高于正常反應組(P<0.05)。低反應組FSH用量明顯高于正常反應組及高反應組(P<0.05),且與E-cadherin呈正相關。高反應組雌二醇水平明顯高于其余各組(P<0.05),低反應組孕酮水平明顯高于其余各組(P<0.05)。 結論 高反應組患者卵泡群發(fā)可能與卵泡局部N-cadherin的高表達有關,而低反應組卵泡發(fā)育受阻可能與高E-cadherin水平有關,使卵泡對FSH反應性降低并有黃素化傾向。

鈣粘素 卵泡 顆粒細胞 卵泡液 性激素

卵泡發(fā)育過程、機制一直是國內外的研究熱點。卵泡被募集或被選擇形成優(yōu)勢卵泡或閉鎖,其具體機制尚不明確。顆粒細胞的增殖、分化、相互作用,顆粒細胞與卵母的關系都借助于細胞粘附,細胞間的相互黏附、信息表達、溝通影響著細胞的相互作用。鈣粘素(cadherin)是其中主要黏附分子,但黏附分子在卵泡發(fā)育中的作用尚知之甚少。目前,關于cadherin與卵泡發(fā)育之間關系的研究主要局限于動物實驗,相關研究亦不多。本研究通過觀察卵泡不同反應患者cadherin的表達情況,旨在探討cadherin在卵泡發(fā)育中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2007-10—2009-05在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院因輸卵管性不孕或男性因素不孕而行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)者70例。根據(jù)給予超排卵周期方案后取卵時平均直徑>14mm的卵泡數(shù)目的不同進行分組,卵泡數(shù)≤5個為卵巢低反應組(低反應組),卵泡數(shù)6~20個為正常反應組,≥21個為卵巢高反應組(高反應組)。3組患者的一般資料見表1,其年齡及不孕時間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 3組患者的一般資料

1.2 超排卵周期方案 所有患者均行基礎激素水平測定,包括基礎促卵泡激素(bFSH)。常規(guī)體外受精或卵胞漿內單精子注射的患者促排卵采用長周期方案,在促排卵周期的前1個月經周期測基礎體溫,當基礎體溫上升后第7天,即在黃體高峰期起每天皮內注射短效促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa),在下1個月經周期第3天始肌注重組FSH促卵泡發(fā)育,周期第8天開始行B超下卵泡監(jiān)測;當最大卵泡平均直徑達18mm或有3個卵泡平均直徑達16mm時停用FSH,并在停用36h后肌肉注射絨毛膜促性腺激素(HCG)10 000U,36h后行陰道B超下取卵術。記錄每例患者的FSH使用劑量。

1.3 標本采集和處理 留取澄清不帶血卵泡液(取卵時選擇卵泡直徑1.8~2.0cm的卵泡)經3 000r/min離心10min后,取上清液-70℃貯存待測。

1.4 卵泡液檢測 檢測卵泡液上皮型 cadherin(E-cadherin)及神經型cadherin(N-cadherin)水平、雌二醇、孕酮水平。采用酶聯(lián)免疫分析儀(德國拜爾公司制造)檢測E-cadherin、N-cadherin,ELISA試劑盒購自USCN LIFE公司。采用免疫化學發(fā)光法測定雌二醇、孕酮均,在全自動免疫分析儀(ACS:180SE,德國拜耳公司),試劑盒由該公司提供。所有標本均為同批檢測,具體操作按試劑盒說明書進行,各項質控均符合要求。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSSl7.0統(tǒng)計軟件,所得數(shù)據(jù)均以 表示,組間比較采用方差分析,相關關系采用Pearson相關分析。

2 結果

3組患者各項檢測指標的比較見表2。

由表2可見,低反應組bFSH明顯高于正常反應組、高反應組(P<0.05)。低反應組FSH用量明顯高于正常反應組及高反應組(P<0.05),且FSH用量與E-cadherin存在正相關性(P<0.05)。高反應組N-cad-herin顯著高于正常反應組及低反應組(P<0.05)。低反應組E-cadherin明顯高于正常反應組(P<0.05)。高反應組雌二醇水平明顯高于其余各組(P<0.05)。低反應組孕酮水平明顯高于其余各組(P<0.05)。

表2 3組患者各項檢測指標的比較

3 討論

黏附分子是位于細胞表面或細胞基質中的糖蛋白,使細胞與細胞間以及細胞與基質間發(fā)生黏附,參與細胞的識別、活化和信號傳導,細胞增殖與分化、伸展與運動是免疫應答、炎癥發(fā)生、凝血、腫瘤轉移、創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過程的分子基礎。不同黏附分子在體內有其獨特的組織分布,其表達隨細胞生長發(fā)育狀態(tài)的不同而不同。cadherin是細胞黏附分子的一種,至今已鑒定出30種以上,主要有E-cadherin(CD324/CDH1)、N-cadherin(CD325/CDH2)等。卵泡在生理周期發(fā)育過程中呈現(xiàn)出不同類型的cadherin的時空表達變化。卵泡顆粒細胞間的相互作用是影響細胞分化、卵泡發(fā)育,導致卵泡排卵或選擇閉鎖的重要因素。

N-cadherin在各卵泡階段顆粒細胞中均有表達,早、中期黃體均有強烈表達[1]。N-cadherin涉及細胞間黏附和組織形態(tài)發(fā)生,也參與信號轉換,以影響各種細胞功能。N-cadherin胞外區(qū)域和成纖維生長因子(bFGF)受體的結構相似(兩者含有共同的保守HAV區(qū)域),而bFGF能影響原始卵泡向初級卵泡轉化。在原始卵泡階段,卵母細胞分泌堿性bFGF和生長分化因子-9以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15等,由此促進顆粒細胞的增殖[2-3]。另外,N-cadherin相互結合啟動信號轉導級聯(lián),經cAMP途徑可抑制顆粒細胞凋亡,調控卵泡閉鎖,維持、促進了卵泡生長發(fā)育[4-5]。同時,N-cadherin介導的細胞接觸可使顆粒細胞表面G蛋白配體與G蛋白相關受體結合影響cAMP[6],刺激、激活信號瀑布級聯(lián),卵母細胞表面的FGF受體激活以防止生發(fā)泡破裂,阻滯減數(shù)分裂[7-8]。卵泡的成熟主要受垂體分泌的FSH和LH通過顆粒細胞介導調控,F(xiàn)SH和LH的作用很大程度上取決于cAMP依賴性信號轉導,cAMP信號通路參與了卵巢卵泡生長的啟動與發(fā)育。本研究結果提示,高反應組N-cadherin高于正常反應組及低反應組,可能與N-cadherin升高,通過堿性bFGF系統(tǒng)及第二信使cAMP信號傳導系統(tǒng),激發(fā)大量的卵泡啟動,對FSH產生應答,誘導眾多卵泡迅速發(fā)育,造成卵泡過度刺激綜合征。由此推測,超促排卵中多囊卵巢綜合征(PCOS)大量卵泡的啟動發(fā)育也可能與之有關。

原始卵泡發(fā)育完成后顆粒細胞表達包括FSH、GnRH、糖皮質激素和雌激素等受體,成為對激素具應答能力的初級卵泡,因此激素與卵泡的啟動無關。E-cadherin在始基卵泡和早期初級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞表達。隨著始基卵泡生長發(fā)動,E-cadherin首先在卵細胞,隨后在顆粒細胞表達消失,cadherin在始基卵泡的表達變化提示E-cadherin可能參與早期卵泡生長始動的調節(jié)[1,9]。本研究結果提示,卵泡液E-cadherin在低反應組明顯高于正常反應組,低反應組基礎促性腺激素水平高于正常反應組及高反應組,卵泡儲備功能差,超促排卵中FSH的用量也明顯高于其他兩組,F(xiàn)SH用量與E-cadherin存在一定正相關。推測可能是高E-cadherin水平使卵泡一直處于早期卵泡狀態(tài),抑制了卵泡的發(fā)育,表現(xiàn)為對FSH刺激呈現(xiàn)低反應性。導致E-cadherin在低反應組中遲遲不降的原因及機制尚待進一步研究。

Peluso等[10]及Machell等[11]的研究結果顯示,未成熟大鼠在促性腺激素治療下顆粒細胞E和N-cadherin的表達類似于性成熟生殖周期中大鼠。促性腺激素所致的黃素化顆粒細胞N-cadherin表達略有減少;而E-cadherin的表達又始于卵泡黃素化,這兩種鈣粘素在黃體完全形成時呈顯著表達。本研究結果提示,低反應組卵泡液E-cadherin及孕酮水平均明顯高于正常反應組、高反應組,孕酮水平的偏高提示卵泡有局部黃素化表現(xiàn)。Luborsky等[12]也發(fā)現(xiàn),在低反應組卵泡液中孕酮顯著高于正常反應組,并且其他一些黃素化指標如VEGF、抑制素A、抑制素A/抑制素B的比值也在低反應組顯著升高??梢娐殉矊Υ傩韵偌に氐头磻c卵泡過早黃素化有關,這可能是低反應組獲卵率低的原因之一。但本研究未發(fā)現(xiàn)E-cadherin的表達與孕酮的分泌具有直接相關性。Lu等[13]認為,含過熟卵丘復合物OCCC組卵泡液中孕酮水平顯著低于成熟、未成熟組,提出排卵前卵泡液中高孕酮水平有助于卵母細胞成熟成長。低反應組中孕酮的變化及意義有待于更多的研究證據(jù)。

E-cadherin在體外未成熟大鼠顆粒細胞中的表達受E2的影響[14],而體內雌激素治療可提高未成熟小鼠卵巢E-cadherin和N-cadherin mRNA的表達。由此推測,激素是調節(jié)E-cadherin、N-cadherin介導的細胞相互作用的一個重要的因子[15]。但本研究結果顯示,低反應組孕酮與E-cadherin均有顯著升高,高反應組雌二醇與N-cadherin均明顯升高,但孕酮與E-cadherin、N-cadherin,雌二醇與E-cadherin、N-cadherin間均無明顯相關性,其相互作用機制有待于進一步研究。Farookhi等[16]發(fā)現(xiàn),E2與FSH能刺激分離的大鼠顆粒細胞中N-cadherinmRNA的表達,但不影響聚合顆粒細胞N-cadherin mRNA的轉錄水平。本研究結果提示,盡管卵泡顆粒細胞受不同劑量FSH刺激,但未呈現(xiàn)出N-cadherin表達量的相關性變化,而E-cadherin與FSH呈正相關。也有研究報道,F(xiàn)SH可修正胚胎原始卵泡形成受損相關的N-cadherin mRNA表達減少及E-cadherin mRNA表達增加[17]。這種表達的改變可被絨毛膜促性腺激素逆轉。本研究中低反應組FSH用量最大,與各組有顯著差別,絨毛膜促性腺激素使用各組劑量無差異而E-cadherin表達增加仍然存在,N-cadherin表達較正常反應組未見減少,可見常規(guī)劑量絨毛膜促性腺激素不能逆轉E-cadherin、N-cadherin的表達改變。綜上所述,卵泡的發(fā)育機制復雜,其中顆粒細胞間、顆粒細胞與卵母細胞間的相互關系非常重要,而黏附分子是其中關鍵之一,進一步研究顆粒細胞間、顆粒細胞與卵母細胞間相互關系及作用機制,探討卵泡發(fā)育機制,對了解病理過程的發(fā)生及探索治療具有極大的臨床意義。

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The expression of cadherin in various follicles reactive groups during superovulation cycle

ZHANG Zhengcheng,ZHANG Zhifen.Wom-

en's Hospital School of Medicine Zhejiang University,Hangzhou 310006,China

【 Abstract】Objective To investigate the levels of E-cadherin,N-cadherin,estradiol,progesterone in human follicular fluid(FF)and its association with different responses to ovarian stimulation. Methods Enzyme-linked immnosorbent assay(ELISA) was performed to determine the levels of E-cadherin,N-cadherin in FF obtained from follicle aspirates in 70 patients undergoing IVF treatment,and chemiluminescence (CL)method was performed to determine the levels of estradiol,progesterone in FF.According to the response to ovarian stimulation the patients were divided into poor responder group(PRG),high responder group(HRG)and normal responder group(NRG).Results N-cadherin levels in FF of HRG were significantly higher than those in NRG and PRG(P<0.05),E-cadherin levels of PRG were significantly higher than those in NRG、HRG(P<0.05).FSH dosages of PRG were significantly higher than those in NRG and HRG (P<0.05).There was a positive correlation between the FSH dosages and the E-cadherin levels.Estradiol levels in FF of HRG were significant higher than those of other two groups(P<0.05).Progesterone levels of PRG were significantly higher than those in other two groups(P<0.05). Conclusion Increased levels of N-cadherin in FF may be associated with the a large number of follicular development in high response to ovarian stimulation.Increased levels of E-cadherin in FF may be associated with the blocked follicular development in PRG,which suggests that the follicles were not sensitive to the stimulation of FSH and there is a tendency to luteinized with the rising of progesterone.

Cadherin Follicular Granulosa cells Follicular fluid Sex hormones

2012-08-15)

(本文編輯:歐陽卿)

浙江省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金項目(2008A17);浙江省科技廳科技計劃項目(2009C33114)

310006 杭州,浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院(張崢程系解放軍第117醫(yī)院婦產科在職研究生);杭州市第一人民醫(yī)院婦產科(張治芬)

張治芬,E-mail:zhangzf@zju.edu.cn

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