孫校男 郭勇

蛋白質(zhì)組學(xué)在姑息期血瘀證大腸癌中的表達(dá)研究

孫校男 郭勇

目的 探討姑息期血瘀證大腸癌血清差異表達(dá)的蛋白質(zhì)及意義。 方法 選取姑息期血瘀證、氣血虧虛證大腸癌患者各6例（血瘀證組、虧虛證組），另擇同期健康平衡體質(zhì)者6例（對照組），通過雙向凝膠電泳以及質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，尋找血瘀證組患者血清中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)。 結(jié)果 血瘀證組出現(xiàn)7種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)：在血瘀證及氣血虧虛證中均升高的蛋白質(zhì)為觸珠蛋白、IL-8、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白、血管生長因子受體-1，均降低的為血清淀粉樣蛋白A；在血瘀證中高表達(dá)而在氣血虧虛證中低表達(dá)的是載脂蛋白A-I前體；而在血瘀證中低表達(dá)且在氣血虧虛證中高表達(dá)的是纖維結(jié)合蛋白。 結(jié)論 7種差異表達(dá)蛋白質(zhì)的組合性變化可能是姑息期血瘀證大腸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有潛在的診斷、評估預(yù)后或指導(dǎo)治療的價值。

大腸癌 瘀血證 血清蛋白 蛋白質(zhì)組學(xué)

大腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，在歐美國家其發(fā)病率高居消化道惡性腫瘤的第一位[1]，在我國的發(fā)病率正逐年增高，已成為威脅生命的一個重要危險因素。目前，大腸癌治療提倡在循證醫(yī)學(xué)原則指導(dǎo)下多學(xué)科綜合的個體化治療，其中中醫(yī)藥治療在改善患者生存質(zhì)量、提高生存率、對放化療增敏減毒、預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面均顯示出了較大的潛力[2]。中醫(yī)治療核心為辨證施治，對于相同疾病不同證型治療采用“同病異治”的原則，而證型間差異的本質(zhì)可能是功能蛋白質(zhì)的差異。本研究旨在對姑息期血瘀證大腸癌中蛋白質(zhì)組學(xué)的表達(dá)進(jìn)行初步分析，以期發(fā)現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)表達(dá)，為臨床治療提供幫助。

1 材料和方法

1.1 血清標(biāo)本 選取2009-01—2009-06浙江省中醫(yī)院收治的晚期結(jié)腸癌患者12例，均經(jīng)病理診斷確診。血瘀證、氣血虧虛證的診斷依據(jù)《現(xiàn)代中醫(yī)臨床診斷學(xué)》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]，符合3項主要癥狀或2項主要癥狀并有2項次要癥狀。排除以其他合并疾病影響大腸癌證候辨證的患者，排除合并有嚴(yán)重的心、肺、腦、肝、腎等臟器疾病的患者，以及神志不清、無法語言交流的患者。其中血瘀證患者6例（血瘀證組），男5例，女1例，年齡45～67（65.83±3.97）歲；腫瘤TNM分期：ⅢB期1例，ⅢC期1例，ⅣA期4例。氣血虧虛證患者6例（氣血虧虛證組），男5例，女1例，年齡47～81（69.83±1.94）歲；腫瘤TNM分期：ⅢB期1例，ⅢC期1例，ⅣA期3例，ⅣB期1例。另擇同期健康平衡體質(zhì)患者6例（對照組），男3例，女3例，年齡55～75（66.16±8.52）歲。3組患者性別及年齡的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器 丙烯酰胺（Acrlamide）、尿素、Tris-HCL、CHAPS、二硫蘇糖醇（DTT）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Cyder染料（Cy2，Cy3，Cy5）、2-D clean up試劑盒、蛋白定量試劑盒、二甲基甲酰胺（DMF）、固相PH梯度膠條（IPG DryStrip，24cm，pH3～10 NL）均購自GE Healthcare公司，碳酸氫銨、氫氧化銨購自國藥集團(tuán)，胰蛋白酶購自sigma公司。EttanTM IPGphorTM等電聚焦電泳儀、EttanTM DALTSix垂直板電泳儀、Typhoon 9400多功能熒光掃描成像系統(tǒng)、DeCyder Image QuantTM V6. 5凝膠圖像分析軟件均為GE公司產(chǎn)品。P80MX超速冷凍離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品，基質(zhì)附助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀4800（MALDI-TOF-TOF-MS）為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 血清處理及蛋白質(zhì)提取 晨間空腹采血，取外周靜脈血3ml于非抗凝的滅菌離心管中，室溫下靜置2h，離心，吸取上清液，保存于-80℃生物冰箱中備用。將各組6份血清等量吸取后混合。經(jīng)Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit親和柱分別除去白蛋白和球蛋白，收集流出液，取上清液用2-D clean up kit去雜，并用2-D定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后調(diào)至統(tǒng)一濃度1.25%，置-80℃保存。

1.3.2 蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記 將CyDye（Cy2,Cy3,Cy5）加入25μl DMF，離心后取出2μl配成200pmol/μl的工作液，每個混合后樣品各取50μg蛋白質(zhì)（每組做2塊重復(fù)膠），調(diào)節(jié)pH值至8.5，加入400pmol相應(yīng)染料，振蕩混勻，1μl賴氨酸中止反應(yīng)，冰上避光放置10min，加入2倍體積緩沖液冰浴10min。

1.3.3 雙向電泳 3組蛋白提取物分別用熒光染料Cy3、Cy5標(biāo)記。3組蛋白提取物等量混合用Cy2標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)。取等量Cy2、Cy3、Cy5標(biāo)記的樣品混合，用水化液定容至450μl，制成第一向等電聚焦體系。樣品加至pH值3～10的非線性膠條中。等電聚焦的參數(shù)：30V 12h；200V 1h；500V 1h；1 000V 1h；8 000V 3h。等電聚集后，將膠條平衡2次（15min/次），IPG膠條轉(zhuǎn)移進(jìn)行第二向電泳，電泳參數(shù)設(shè)定為：30W 45min；100W 6h。至溴酚藍(lán)染料遷移至膠的底部邊緣，結(jié)束電泳。

1.3.4 圖像掃描分析與質(zhì)譜分析 熒光標(biāo)記蛋白經(jīng)凝膠電泳后在Typhoon9400熒光掃描儀上成像，所用的濾光片和PTM電壓如下：Cy2：Blue2（488）/600；Cy3：Green（530）/680；Cy5：Red（633）/590。 用 DeCyderImage QuantTM V6.5圖像分析軟件進(jìn)行點(diǎn)識別、背景消除、點(diǎn)匹配及差異蛋白質(zhì)分析。然后將需要進(jìn)行鑒定分析的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)切下、脫色、透明、酶解、萃取、脫鹽和吸干，用于質(zhì)譜分析。將樣品放入質(zhì)譜儀中進(jìn)行MALDI-TOF-TOF-MS檢測，得到肽質(zhì)量指紋圖譜，通過Mascot數(shù)據(jù)搜索鑒定蛋白質(zhì)。當(dāng)匹配分?jǐn)?shù)達(dá)到或超過軟件規(guī)定分值時，待測蛋白的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中某已知蛋白的氨基酸序列覆蓋率較高，即認(rèn)為匹配的可能性很大；反之，則認(rèn)為匹配的可能性較小。

2 結(jié)果

雙向電泳后用488、530、633nm的3種波長的激發(fā)光進(jìn)行掃描膠塊，獲得不同組樣品蛋白質(zhì)組圖譜（圖1）。選擇血瘀證組與氣血虧虛證組、平衡體質(zhì)組相比較表達(dá)差異超過15%的蛋白質(zhì)作為差異蛋白質(zhì)，其圖譜分析見圖2，其中MTA1、VEGFR-1、Haptoglobin的肽指紋圖譜見圖3。血瘀證組差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)相關(guān)信息及質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1，可見血瘀證組出現(xiàn)7種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)：在血瘀證及氣血虧虛證中均升高的蛋白質(zhì)為觸珠蛋白、IL-8、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（MTA1）、血管生長因子受體-1（VEGFR-1），均降低的為血清淀粉樣蛋白A（SAA）；在血瘀證中高表達(dá)而在氣血虧虛證中低表達(dá)的是載脂蛋白A-I前體；而在血瘀證中低表達(dá)且在氣血虧虛證中高表達(dá)的是纖維結(jié)合蛋白。

3 討論

中醫(yī)關(guān)于血瘀證的論述，最早出現(xiàn)在《內(nèi)經(jīng)》中“惡血”、“凝血”等名?！妒?jì)總錄》中記載：“瘤之為義，流滯而不去也”，反映了惡性腫瘤與血瘀證之間有非常密切的關(guān)系。相關(guān)實驗研究也證實了腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移與血液流變學(xué)變化呈正相關(guān)[4]，且其血液的高凝狀態(tài)隨著隨疾病進(jìn)展有增高趨勢[5]。本研究結(jié)果顯示，血瘀證組及虧虛證組中均升高的為觸珠蛋白、IL-8，均降低的為SAA；在血瘀證組中高表達(dá)而在虧虛證組中低表達(dá)的是MTA1、載脂蛋白A-I前體、VEGFR-1；而在血瘀證組中低表達(dá)且在虧虛證組中高表達(dá)的是纖維結(jié)合蛋白。

圖1 蛋白質(zhì)組圖譜（a：平衡體質(zhì)組，b：血瘀組，c：氣血虧虛證組）

圖2 血瘀組蛋白質(zhì)組差異分析圖

圖3 蛋白質(zhì)肽指紋圖譜

表1 蛋白質(zhì)點(diǎn)相關(guān)信息及質(zhì)譜鑒定結(jié)果

MTA1是一個與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)、具有組蛋白脫乙酰基活性的基因，通過改變組蛋白的乙?；癄顟B(tài)進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，在信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮一定作用。目前，多項研究證實MTA1與多種惡性腫瘤的預(yù)后有關(guān)。Higashijima[6]等對74例術(shù)后大腸癌患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)免疫組化MTA1陽性組患者5年生存率為50.5%，MTA1陰性組患者5年生存率為73.1%。本研究中血瘀證組及氣血虧虛證組患者均有MTA1的升高，而血瘀證患者的表達(dá)高于氣血虧虛證患者，提示血瘀證患者更易出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

血管內(nèi)皮生長因子屬血小板源性生長因子家族的生長因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管的發(fā)生。其特異性地與相應(yīng)的VEGFR-1相結(jié)合使受體自身磷酸化而激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。目前，臨床發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的血管形成關(guān)系密切，并與抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)[7]。Li等[8]發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中侵襲力強(qiáng)的細(xì)胞VEGFR-1較侵襲力低的細(xì)胞表達(dá)量高，肝癌組織中其表達(dá)也高于癌旁組織。本研究結(jié)果亦顯示，血瘀證患者VEGFR-1的表達(dá)明顯高于對照組及氣血虧虛，提示預(yù)后不佳。

觸珠蛋白是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，由2條輕鏈（α鏈）和2條重鏈（β鏈）組成四聚體，其主要功能是與游離血紅蛋白結(jié)合將其運(yùn)至肝中代謝。觸珠蛋白還能促進(jìn)新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞分化和生長，是一種重要的血管生成因子。Sun[9]等采用免疫組化的方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者中觸珠蛋白較無轉(zhuǎn)移者更高，考慮可能對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移有預(yù)示作用。Sarvari等[10]研究發(fā)現(xiàn)，觸珠蛋白α-2鏈在肝癌中較肝硬化中表達(dá)更高。本研究結(jié)果顯示，觸珠蛋白在血瘀證組及氣血虧虛證組中均升高，且在血瘀證中表達(dá)更顯著，提示血瘀證腫瘤患者較氣虛虧虛證患者預(yù)后更差。

纖維結(jié)合蛋白在抗感染、維持微血管的完整性等方面具有重要作用。纖維連接蛋白的合成減少和（或）降解增加，導(dǎo)致細(xì)胞表面結(jié)合力下降，使癌細(xì)胞脫離原發(fā)部位，在組織間遷徙，形成轉(zhuǎn)移灶。本研究中血瘀證患者纖維連接蛋白下調(diào)提示易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。血瘀證中存在血液高凝狀態(tài)，導(dǎo)致組織缺氧，酸中毒，而腫瘤是血管依賴性的，因而腫瘤血管生成的因子的大量分泌，促進(jìn)腫瘤血管供血，提示預(yù)后不佳。本研究發(fā)現(xiàn)血瘀證患者M(jìn)TA1、觸珠蛋白、VEGFR-1與腫瘤血管生長及腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白均高表達(dá)，而維持血管完整性的纖維蛋白合成減少提示預(yù)后不佳。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)其中IL-8、SAA、載脂蛋白A-I前體與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-8與肝癌細(xì)胞的浸潤性生長或轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。腫瘤細(xì)胞的浸潤性生長或轉(zhuǎn)移可使內(nèi)皮細(xì)胞遭到破壞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，刺激機(jī)體免疫活性細(xì)胞分泌大量IL-8等細(xì)胞因子。本研究中血瘀證組IL-8的表達(dá)明顯高于其他兩組。汪曉東等[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者SAA水平升高，并發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的提高其水平也增高。但在本研究中發(fā)現(xiàn)此蛋白均較對照組下降，具體原因及機(jī)制尚不明。血清載脂蛋白Al前體除了在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮核心作用，亦具有抗炎作用，抑制單核巨噬的活化和釋放IL-1β、TNF-α等炎性因子。本研究中血瘀證組患者血清載脂蛋白Al前體高表達(dá)，提示機(jī)體抑制過劇烈的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的7種差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及炎癥反應(yīng)及腫瘤血管生長及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面，這些蛋白質(zhì)的組合性變化可能是大腸癌血瘀證的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有潛在的診斷、評估預(yù)后或指導(dǎo)治療的價值。但本研究發(fā)現(xiàn)的7種蛋白質(zhì)是大腸癌共有還是血瘀證特有尚需進(jìn)一步研究證實。

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Proteomics and TCM syndromes in palliative stage of colorectal cancer

SUN Xiaonan，GUO Yong.Affiliated Hangzhou Xixi Hospital

of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053,China

【 Abstract】Objective To investigate differentially expressed serum proteins in palliative stage colorectal cancer patients with blood stasis syndrome and blood/qi deficiency syndrome. Methods Two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry were used to screen the differentially expressed serum proteins among 18 patients with blood stasis syndrome and blood and qi deficiency syndrome;6 healthy subjects with yin-yang harmony served as controls. Results Interleukin-8 and haptoglobin were highly expressed in patients with blood and qi deficiency syndrome and blood stasis syndrome; while serum amyloid A protein precursor(SAA)was decreased in both groups.Metastasis-associated protein,apolipoprotein A-I precursor,vascular endothelial growth factor receptor-1 were highly expressed in blood stasis syndrome group while decreased in patients with blood and qi deficiency syndrome.Fibronectin was decreased in patients with blood stasis syndrome,while highly expressed in patients with blood and qi deficiency syndrome. Conclusion The proteins identified in this study may be related to the development of blood stasis syndrome in patients with colorectal cancer and might be used as molecular targets for diagnosis and treatment of the syndrome.

Colorectal cancer Blood stasis syndrome Serum protein Proteomics

2012-07-13）

（本文編輯：歐陽卿）

浙江省中醫(yī)藥科技計劃重大項目（2007ZA007），浙江省中醫(yī)藥科技計劃一般項目（2011CA031）

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市西溪醫(yī)院（孫校男）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（郭勇）