劉彤，李丹妮，李洋，李豐

(1．中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室/教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110001;2．中國醫(yī)科大學(xué) 七年制臨床醫(yī)學(xué)94期，遼寧沈陽 110001)

PAK(P21-activated kinase)是Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)下游保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PAK家族成員參與許多重要的細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞移動(dòng)/遷移、細(xì)胞凋亡與生存、細(xì)胞周期與有絲分裂，而且與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1-3］。PAK家族有6個(gè)成員，第Ⅰ亞類包括PAK1-3，第Ⅱ亞類包括PAK4-6。第Ⅰ亞類成員含有自我抑制域，其激活依賴于上游 Rho-GTPase，如 Cdc42/Rac1。而第Ⅱ亞類成員不含有自我抑制域，表達(dá)后擁有持續(xù)的激酶活性［4-5］。

PAK6為Ⅱ類PAK家族的成員之一，它是以AR的配體結(jié)合域(LBD)上的氨基酸序列629-919，通過酵母雙雜交識(shí)別篩選出來的雄激素受體關(guān)聯(lián)蛋白，主要表達(dá)于前列腺、睪丸和大腦等器官［6］。PAK6基因總長(zhǎng)2 055個(gè)堿基對(duì)，編碼681個(gè)氨基酸，表達(dá)75 kDa蛋白質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PAK6能與細(xì)胞骨架關(guān)聯(lián)蛋白IQGAP1(IQ domain-containing GTPase-activating protein 1)相互作用，提示PAK6可能在神經(jīng)發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用［7-8］。PAK6能夠同時(shí)與雄激素受體與雌激素受體相互作用［9］，顯示PAK6與激素類受體的生理學(xué)功能相關(guān)聯(lián)。PAK6在前列腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其是在雄激素非依賴的情況下PAK6的過表達(dá)尤為明顯［8］，說明PAK6在前列腺癌的惡性進(jìn)程中具有重要的作用，而且PAK6能夠磷酸化雄激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并以激酶依賴性的方式抑制雄激素受體的轉(zhuǎn)錄激活作用［10］。因此構(gòu)建PAK6真核表達(dá)載體并確定其亞細(xì)胞定位對(duì)研究PAK6的生物學(xué)功能有重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過PCR擴(kuò)增PAK6基因，構(gòu)建了PAK6真核表達(dá)質(zhì)粒并確定了PAK6蛋白的亞細(xì)胞定位。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞以及人胚腎HEK293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，pcDNA3.1HisC真核表達(dá)載體及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000購于美國Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清購自GIBCO公司。各種限制性內(nèi)切酶、PyrobestTM DNA polymerase、電泳凝膠回收試劑盒均購自TakaRa公司;質(zhì)粒純化抽提試劑盒購自Promega公司。蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自MBI公司，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自 TaKaRa公司。T4 DNA連接酶購自NEB公司，引物序列合成及DNA序列測(cè)定由南京金斯瑞有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Anti-PAK6抗體購自Abcam公司，Anti-His抗體購于南京金斯瑞公司，Anti-GAPDH、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購自上?？党晒?，Alex Flour 488綠色熒光染料購自Molecular Probes公司。

1．2 PAK6真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以胎腦文庫cDNA為模板，利用PyrobestTM DNA polymerase設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PAK6基因的PCR擴(kuò)增獲得片段。將擴(kuò)增的片段利用EcoRⅠ/XhoⅠ酶切后用T4 DNA連接酶連接到經(jīng)同樣酶切的pcDNA3.1HisC真核表達(dá)載體上，16℃過夜，得到連接產(chǎn)物。取3 μl上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E．coli DH5α中，涂布于含氨芐西林的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落4個(gè)，接種于含氨芐西林3 ml的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩過夜。用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并送去南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序正確后，將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1HisC-PAK6。

1．3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PAK6蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)

HEK293細(xì)胞正常培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞的融合度達(dá)到60%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)16 h后收集細(xì)胞。RIPA裂解液中裂解細(xì)胞沉淀以提取總蛋白［50 mmol·L－1Tris/HCl(pH 7.4)，150 mmol·L－1NaCl，1%Nonidet P-40，0.25%Na-deoxycholate，1 mmol·L－1EDTA and protease inhibitor cocktail］。裂解提取的總蛋白定量變性后，取等量蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離，恒流0.09 mA轉(zhuǎn)印2 h至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜 15 min×3，加入 Anti-PAK6 抗體(1∶1 000)，室溫1 h，TBST洗膜15 min×3，加入 HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫1 h，TBST洗膜15 min×3，ECL顯色。

1．4 PAK6蛋白在真核細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染后(同上述免疫印跡實(shí)驗(yàn))于4%多聚甲醛中固定，加入羊血清封閉1 h。用含有0.1%Triton-X100的PBS洗細(xì)胞15 min×3，加入Anti-His/Anti-PAK6抗體(1∶100)室溫孵育1 h，PBS洗細(xì)胞15 min×3。Alex Flour 488孵育1 h，PBS洗細(xì)胞15 min×3。Olympus顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2．1 PAK6真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以胎腦文庫cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PAK6基因，得到約2 000 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

將構(gòu)建成功的pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ酶切后得到5.0 kb和2.0 kb左右大小的兩條特異性片段，與預(yù)期大小相符，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

圖1 PCR擴(kuò)增PAK6基因片段Fig 1 PCR fragment of PAK6 gene

圖2 pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒酶切圖Fig 2 The enzyme digestion of pcDNA3.1HisC-PAK6

2．2 pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)

將純化抽提的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1HisC空載體和pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。提取的總蛋白在10%SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)膜后，我們用抗PAK6單克隆抗體進(jìn)行Western blotting鑒定。結(jié)果(圖3)顯示，在第2泳道有一特異性結(jié)合抗體的條帶(箭頭所示)，與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)后，大小正確，說明pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)PAK6蛋白。

2．3 PAK6蛋白在真核細(xì)胞的亞細(xì)胞定位

將純化抽提的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1HisC空載體和pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞?？蛰d體用Anti-His抗體孵育，pcDNA3.1HisC-PAK6用Anti-PAK6抗體孵育。染色結(jié)束后利用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果(圖4)顯示，pcDNA3.1HisC空載體的綠色熒光遍布整個(gè)細(xì)胞，而pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒表達(dá)在細(xì)胞漿中，說明PAK6蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿中。

圖3 pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)PAK6蛋白Fig 3 The expression of pcDNA3.1HisC-PAK6 in HEK293 cells

圖4 PAK6蛋白在HEK293細(xì)胞中的定位Fig 4 The subcellular localization of PAK6 in HEK293 cells

3 討 論

PAK6是PAK家族中最晚發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成員，其生物學(xué)功能并未像家族其他成員一樣研究得比較詳盡。目前，PAK6的主要功能是與雄激素受體相互作用并通過磷酸化調(diào)節(jié)AR的轉(zhuǎn)錄活性［6］。PAK6蛋白表達(dá)與前列腺癌的惡性進(jìn)程密切相關(guān)，尤其是在難以治療的復(fù)發(fā)性前列腺癌中［8］。復(fù)發(fā)性前列腺癌通常都是在采取去除雄激素以治療原發(fā)性前列腺癌的患者中發(fā)病，這類患者通常都會(huì)伴有腫瘤的轉(zhuǎn)移，例如骨轉(zhuǎn)移，因此難以治愈［11］。

本研究構(gòu)建了pcDNA3.1HisC-PAK6真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序及酶切鑒定證實(shí)PAK6被成功導(dǎo)入pcDNA3.1HisC載體中。此質(zhì)粒能夠表達(dá)PAK6蛋白并指示PAK6蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿中。在圖4中，空載體所示綠色熒光遍布于整個(gè)細(xì)胞，無特異性的亞細(xì)胞定位。另外，由于pcDNA3.1HisC空載體的表達(dá)對(duì)細(xì)胞影響較小，其表達(dá)也比右側(cè)pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒表達(dá)較強(qiáng)。pcDNA3.1HisC-PAK6質(zhì)粒與空載體相比明顯表達(dá)于細(xì)胞漿中。有文獻(xiàn)報(bào)道，綠色熒光蛋白標(biāo)簽的PAK6質(zhì)粒也表達(dá)于細(xì)胞漿中［10］，但綠色熒光蛋白標(biāo)簽分子量較大，為34 kDa。在研究PAK6的生物學(xué)功能時(shí)容易發(fā)生阻滯PAK6核轉(zhuǎn)位以及引起非特異性反應(yīng)等弊端。本研究中構(gòu)建的pcDNA3.1HisC-PAK6真核表達(dá)質(zhì)粒所帶有的6×His標(biāo)簽蛋白僅為6個(gè)氨基酸大小，不容易引起非特異性的反應(yīng)，更利于研究PAK6的生物學(xué)功能。本研究構(gòu)建的PAK6真核表達(dá)載體并且確定其在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位對(duì)于闡述PAK6的生物學(xué)功能具有重要的作用。

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