許 姍 陳貴妙 林陳勝 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108

細(xì)胞凋亡（apoptosis），是多細(xì)胞生物體調(diào)控機(jī)體發(fā)育，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡一詞提出至今已有40多年。隨著細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，對(duì)其分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了更深入的了解，細(xì)胞凋亡已逐漸成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。

長(zhǎng)期以來(lái)，細(xì)胞凋亡往往又被稱為程序性細(xì)胞死亡（programmed ce11death，PCD），兩種名稱經(jīng)常被混淆使用，而事實(shí)上，兩者的涵義是不同的。PCD是機(jī)制上的概念，用于描述發(fā)生于各生物種系胚胎發(fā)育過(guò)程中的正常細(xì)胞死亡的所有表型，具高度可遺傳的時(shí)序性和空間性，即細(xì)胞在發(fā)育的特定階段按序死亡。而細(xì)胞凋亡是形態(tài)學(xué)的概念，是對(duì)多種方式引起的一種特征性形態(tài)和生化改變的概括。它并非代表引起細(xì)胞死亡的過(guò)程和路徑而是指眾多因素造成的眾多死亡途徑的最終表現(xiàn)。

早在19世紀(jì)，發(fā)育生物學(xué)家就發(fā)現(xiàn)無(wú)論是胚胎發(fā)育過(guò)程中，還是胚后發(fā)育，均存在細(xì)胞的死亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡機(jī)制已經(jīng)包含在許多精細(xì)的組織器官胚胎發(fā)育中，如腎臟、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、上皮組織等，它通過(guò)控制細(xì)胞數(shù)目和組織形狀，在器官形態(tài)發(fā)生和形成時(shí)起重要作用［1］。

1 牙齒發(fā)育中的細(xì)胞凋亡

哺乳動(dòng)物牙齒發(fā)育是由外胚層來(lái)源的上皮細(xì)胞和顱神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞共同分化而來(lái)的，其中牙釉質(zhì)由上皮細(xì)胞分化形成，牙本質(zhì)、牙髓等其他結(jié)構(gòu)是由間充質(zhì)細(xì)胞分化形成。在組織形態(tài)學(xué)上，人類的牙齒發(fā)生與小鼠的磨牙發(fā)生極為相似［2］。在小鼠中，牙齒發(fā)生的定位是在胚胎發(fā)育的E10.5（胚胎齡第10.5 d）［2］。哺乳動(dòng)物的牙齒發(fā)育均會(huì)經(jīng)歷一系列上皮增厚的過(guò)程：牙板期、牙蕾期、帽狀期和鐘狀期，同時(shí)伴隨著牙釉質(zhì)的分泌礦化［3］。牙齒的形態(tài)發(fā)生是在特定時(shí)空所發(fā)生的由諸多相關(guān)基因嚴(yán)格調(diào)控的一系列生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的抑制或刺激、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等［4］。

牙齒作為研究哺乳動(dòng)物器官發(fā)育的一個(gè)模型，其細(xì)胞凋亡已有大量研究。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠牙胚發(fā)育中存在著細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，提示細(xì)胞凋亡在牙齒發(fā)育中有重要作用［5］。同時(shí)，應(yīng)用TUNEL技術(shù)研究小鼠牙胚發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡參與了牙上皮與牙間充質(zhì)的相互作用，調(diào)控牙尖、牙頸及牙根的形成，發(fā)揮塑形作用［6］。

細(xì)胞凋亡最早發(fā)生在蕾狀期，表明細(xì)胞凋亡參與了牙蕾結(jié)構(gòu)的形成［7］。帽狀期，細(xì)胞凋亡位于原發(fā)性釉結(jié)節(jié)（Primary ename1knot）中。隨著牙胚發(fā)育進(jìn)入鐘狀期，細(xì)胞凋亡又在繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)（Secondary ename1knot）中出現(xiàn)。這一結(jié)果表明，釉結(jié)節(jié)在完成其誘導(dǎo)牙尖形成的功能后，通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制而被清除。用體外重組實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)細(xì)胞凋亡在牙胚發(fā)育中的作用。將E13小鼠牙胚的上皮與間充質(zhì)分離后分別進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上皮和間充質(zhì)中均有凋亡細(xì)胞。當(dāng)兩者共培養(yǎng)時(shí)，在兩個(gè)組織接觸的區(qū)域細(xì)胞凋亡受到明顯抑制。這個(gè)結(jié)果表明上皮與間充質(zhì)的相互作用可以抑制細(xì)胞凋亡。將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4（FGF-4）加入培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制間充質(zhì)的細(xì)胞凋亡。因此，信號(hào)因子的作用會(huì)影響上皮與間充質(zhì)的相互作用，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5］。

小鼠磨牙牙胚中，原發(fā)性釉結(jié)節(jié)參與了牙齒從蕾狀期向帽狀期的轉(zhuǎn)變過(guò)程［8］。牙胚發(fā)育至帽狀期，凋亡細(xì)胞主要集中在內(nèi)釉上皮凹面中心區(qū)域（即原發(fā)性釉結(jié)節(jié)）。隨著牙胚發(fā)育至鐘狀期，研究證實(shí)繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)決定著未來(lái)牙尖的位置，調(diào)節(jié)牙胚形狀，尤其是牙尖形成的信號(hào)調(diào)控中心［9］。原發(fā)性釉結(jié)節(jié)與繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)均表達(dá)了一系列的信號(hào)分子，如Fgf-4，參與了細(xì)胞凋亡［9］。隨后，有研究發(fā)現(xiàn)存在著第三種釉結(jié)節(jié)，出現(xiàn)在靠近牙尖無(wú)釉質(zhì)分泌的區(qū)域，研究認(rèn)為其對(duì)于調(diào)控釉質(zhì)的沉積有重要的作用［10］。Mata1ova等利用激光捕獲顯微切割技術(shù)，將原發(fā)性釉結(jié)節(jié)分離培養(yǎng)細(xì)胞，研究結(jié)果表明，此類細(xì)胞是研究牙齒發(fā)育中細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的一類重要的細(xì)胞［11］。已有超過(guò)50種基因被證實(shí)在釉結(jié)節(jié)中有顯著表達(dá)，如 Shh、Bmp-2、Bmp-4、Bmp-7、Fgf-4 等［12］。釉結(jié)節(jié)在完成其誘導(dǎo)牙齒發(fā)育及其信號(hào)調(diào)控作用后，通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制而被清除。

2 牙齒發(fā)育中細(xì)胞凋亡相關(guān)因子

發(fā)育中的細(xì)胞凋亡，是在許多基因調(diào)控下發(fā)生的生理性現(xiàn)象，其中Caspases和Bc1-2基因家族等是重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子。

2.1 Caspases Caspases（cysteiny 1 aspartate-specific proteases），是一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，能夠特異地切割天冬氨酸殘基后的肽鍵，是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，該家族成員按其發(fā)現(xiàn)先后分別被命名為Caspase 1-14。Caspases-3是Caspases家族中最主要的凋亡執(zhí)行者之一，可促進(jìn)凋亡，并被Bc1-2阻止。在牙胚中Caspases-3陽(yáng)性細(xì)胞與Tune1陽(yáng)性凋亡細(xì)胞分布一致，表明在牙齒發(fā)育期細(xì)胞凋亡可能是由于激活了 Caspases家族［13-14］。

利用 Caspases-3突變鼠（knock-out）研究 Caspases-3在牙齒發(fā)育中的功能［15］，發(fā)現(xiàn)在突變鼠的原發(fā)性釉結(jié)節(jié)中檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的存在，第一磨牙有暫時(shí)性的改變。然而，這些形態(tài)學(xué)的變化在隨后的發(fā)育過(guò)程中都得以補(bǔ)償，最終形成正常的牙齒形態(tài)。因此，Caspases-3雖然參與了牙齒的細(xì)胞凋亡，但是似乎不是牙齒形成所必須的。在牙齒發(fā)育早期，特別是在原發(fā)性釉結(jié)節(jié)中，Caspases-3的缺乏并不會(huì)影響最終恒牙的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和組織分化。

在Caspases-9和Apaf-1突變鼠中，在原發(fā)性釉結(jié)節(jié)中并未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞凋亡［16］。與Caspases-3突變鼠不同的是，Caspases-9和Apaf-1突變鼠在鐘狀期并未發(fā)生形態(tài)學(xué)上的變化。雖然在原發(fā)性釉結(jié)節(jié)中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，但是從帽狀期到鐘狀期的轉(zhuǎn)變與野生型小鼠的表型一致。因此，認(rèn)為這種放大機(jī)制，特別是通過(guò)凋亡受體作用，是線粒體與Caspases之間連接進(jìn)行協(xié)同作用，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［17］。

有研究報(bào)道利用磨牙離體培養(yǎng)檢測(cè)Caspases（半胱天冬酶）的抑制作用［18］。在E13.5小鼠磨牙的離體培養(yǎng)中，通過(guò)藥物抑制Caspases的活性，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)上并未有明顯變化。由于Caspases被抑制細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生凋亡，釉結(jié)節(jié)依然存在并未消失。同時(shí)，在存留的釉結(jié)節(jié)中，Shh、Msx-2、Bmp-2、Bmp-4 等基因的表達(dá)下調(diào)，表明釉結(jié)節(jié)中信號(hào)的缺失能夠引起其本身不被消除。因此，細(xì)胞凋亡的缺失，不會(huì)影響牙齒形態(tài)的形成。細(xì)胞凋亡的作用可能僅僅只是清除停止生長(zhǎng)的細(xì)胞，而不是抑制釉結(jié)節(jié)發(fā)揮其信號(hào)調(diào)節(jié)作用。然而，運(yùn)用Caspases抑制劑干擾早期牙齒發(fā)育，卻發(fā)現(xiàn)牙齒的形態(tài)最終被改變，因此，釉結(jié)節(jié)中發(fā)生的細(xì)胞凋亡對(duì)于牙齒正常的形態(tài)和大小也是必要的［19］。關(guān)于釉結(jié)節(jié)中所發(fā)生的細(xì)胞凋亡的準(zhǔn)確作用，仍然需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

2.2 Bc1-2/Bax Bc1-2是從濾泡性淋巴瘤中分離出的一種原癌基因［20］。已知Bc1-2通過(guò)控制核內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸、抑制Ca2+的釋放或阻斷細(xì)胞內(nèi)外過(guò)氧化物的堆積而抑制細(xì)胞的凋亡。而B(niǎo)ax基因是第一個(gè)分離到的Bc1-2同源基因，可與Bc1-2形成異源二聚體（Bc1-2/Bax）從而拮抗Bc1-2抑制細(xì)胞凋亡的作用，是一種凋亡相關(guān)基因。Bc1-2與Bax所形成的異源二聚體中兩者的比例決定細(xì)胞到底該向存活還是死亡的方向發(fā)展［21］。

Bc1-2在牙齒發(fā)育的早期表達(dá)較強(qiáng)，在牙體組織形成后表達(dá)下調(diào)［22］。在成釉細(xì)胞中也檢測(cè)到Bc1-2的表達(dá)［23］。表明Bc1-2基因在牙齒形態(tài)形成過(guò)程中，是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、成熟、消亡的重要因素。

有研究發(fā)現(xiàn)，大部分牙胚細(xì)胞均同時(shí)表達(dá)Bc1-2和Bax［24］。Bax在外釉上皮中表達(dá)更強(qiáng)，而在內(nèi)釉上皮中Bc1-2表達(dá)更強(qiáng)。星網(wǎng)層中，有一些細(xì)胞僅單一表達(dá)Bc1-2或者Bax，也有一些兩者同時(shí)表達(dá)。間充質(zhì)中大部分只表達(dá)Bax。利用轉(zhuǎn)基因小鼠在成牙本質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Bc1-2，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Bc1-2會(huì)導(dǎo)致牙齒發(fā)育過(guò)程的異常，成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡受抑制［25］。然而，雖然成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖率或死亡率均受到了影響，但突變鼠與野生鼠中成牙本質(zhì)細(xì)胞的密度并未發(fā)現(xiàn)明顯變化。成牙本質(zhì)細(xì)胞密度未改變，可能是由于牙髓腔體積的均衡變化（突變鼠的牙髓腔比野生型的大），也可能是由于其他未知的原因，仍需要更深入的研究。

3 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞凋亡存在于牙齒發(fā)育的各個(gè)階段，也已被證實(shí)在細(xì)胞的增殖和消亡方面有重要的作用，控制著整個(gè)牙齒的發(fā)育進(jìn)程。釉結(jié)節(jié)作為信號(hào)中心，其細(xì)胞凋亡也對(duì)牙齒的形成有重要影響。牙齒發(fā)育過(guò)程中受到多種自身基因的調(diào)控，細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和進(jìn)行源于這些基因的相互作用。實(shí)驗(yàn)已初步揭示這些凋亡基因在牙齒發(fā)育中的重要影響，但細(xì)胞凋亡在發(fā)育中的準(zhǔn)確作用尚未明確表明。因此，對(duì)牙齒發(fā)育中細(xì)胞凋亡信號(hào)分子的深入研究，不僅對(duì)于我們認(rèn)識(shí)其發(fā)生機(jī)制有益，更重要的是對(duì)臨床診斷及其相關(guān)疾病預(yù)防和治療有重大的幫助。

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