劉 偉黃 瑜

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350000；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

鴨傳染性漿膜炎最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)的紐約，其后在英國(guó)、加拿大等國(guó)發(fā)生，我國(guó)于1982年首次報(bào)道該病的存在，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一。臨診表現(xiàn)為困倦，眼與鼻孔有分泌物，排白色黏稠樣糞便，神經(jīng)癥狀如共濟(jì)失調(diào)、抽搐、頭頸震顫等，慢性病例可見斜頸。病理變化特點(diǎn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。臨診中該病易與鴨大腸桿菌病混淆，建立快速、及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有重要意義，有助于治療藥物的選擇，減少經(jīng)濟(jì)損失。本文就鴨傳染性漿膜炎檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行綜述。

1 傳統(tǒng)的鴨傳染性漿膜炎檢測(cè)方法

1.1 病原的分離鑒定 初次分離時(shí)無(wú)菌采取病死鴨心血、肝臟或腦組織，在巧克力培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板上劃線，在含有二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)，平板上會(huì)長(zhǎng)出表面光滑的菌落，稍突起，圓形，直徑1～1.5 mm，若繼續(xù)培養(yǎng)菌落可達(dá)2 mm。鴨疫里默氏菌不能在普通瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在血瓊脂上不產(chǎn)生溶血。該菌革蘭氏染色為陰性小桿菌，無(wú)芽孢，有莢膜，瑞氏染色為兩極濃染。

細(xì)菌的分離鑒定需要時(shí)間較長(zhǎng)，一般為2～3 d，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于常規(guī)的臨床診斷，也不適合于大規(guī)模集約化生產(chǎn)中鴨疫里默氏菌病的檢測(cè)。

1.2 生化試驗(yàn) 該菌不發(fā)酵碳水化合物，但少數(shù)菌株能發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖或肌醇，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫，可液化明膠，接觸酶試驗(yàn)和尿素酶分解皆為陽(yáng)性，西檬氏枸杞酸鹽利用陰性，氧化酶、過(guò)氧化氫酶、磷酸酶陽(yáng)性。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)方法

1.3.1 平板凝集試驗(yàn) 將陽(yáng)性血清（適當(dāng)稀釋）與待檢菌懸液各一滴滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，出現(xiàn)顆粒狀或絮狀沉淀者為陽(yáng)性。該試驗(yàn)用于鴨疫里默氏菌的血清型初步鑒定，操作簡(jiǎn)便快速。但敏感性較低，還有可能發(fā)生不同血清型間的交叉反應(yīng)。

1.3.2 試管凝集試驗(yàn) 用來(lái)檢測(cè)血清中是否存在相應(yīng)抗體，測(cè)定抗體的效價(jià)，也用于對(duì)玻片凝集試驗(yàn)中表現(xiàn)交叉反應(yīng)的分離株進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)以及明確各型標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的抗原關(guān)系［1］。操作簡(jiǎn)單快速，敏感性較低。

1.3.3 間接血凝試驗(yàn) 高福等［2］報(bào)道了用瓊脂擴(kuò)散抗原致敏戊二醛化的綿羊紅血球來(lái)檢測(cè)血清中RA抗體，初步證明其敏感性較高。

1.4 瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn) 利用可溶性抗原和抗體在半固體凝膠中進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)抗原抗體分子相遇并達(dá)到相應(yīng)比例時(shí)，就會(huì)相互結(jié)合，凝集，出現(xiàn)白色的沉淀線，從而判定相應(yīng)的抗原和抗體。該試驗(yàn)用于鴨疫里默氏菌的血清型初步鑒定，敏感性也較低。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 檢測(cè)抗體常用的方法之一，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，相對(duì)于凝集試驗(yàn)和沉淀試驗(yàn)，ELISA具有更高的敏感性，從而適合于對(duì)血清中的RA抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)［1］。

Hatfie1d等（1987）建立了用ELISA方法來(lái)檢測(cè)鴨血清中抗RA抗體，但其抗原為2型RA的裂解菌體，并且應(yīng)用了酶標(biāo)記驢抗兔IgG，操作步驟和試驗(yàn)結(jié)果判定都較為復(fù)雜。

張鶴曉等［3］用裂解的1型RA菌體作為包被抗原，建立了特異性強(qiáng)，重復(fù)性良好且敏感性高的檢測(cè)鴨血清中RA1型抗體的ELISA方法。該方法可作為鴨傳染性漿膜炎感染的血清流行病學(xué)調(diào)查和對(duì)其疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。方法如下：制備RA抗原，自制陽(yáng)性血清和陰性血清，酶標(biāo)兔抗鴨IgG的制備，底物溶液的配制，洗滌液中NaC1濃度對(duì)非特異性吸附影響的測(cè)定，進(jìn)行ELISA。

蘇敬良等［4］、程龍飛等［5］、程安春等［6］又分別建立了檢測(cè)2型、3型、4型RA抗體的ELISA方法。Huang等［7］以 RA15型的OmpA 基因（P45）編碼 N-端的41 ku蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行重組表達(dá)的蛋白建立間接ELISA方法，可以對(duì)多種RA的早期感染進(jìn)行有效的檢測(cè)。辜新貴等［8］根據(jù)克隆的RA1型的一種“保守的假定蛋白（conserved hypothetica1protein）”基因（ P25）（ GenBank Accessio No：EU072443）進(jìn)行重組表達(dá)，建立以重組P25蛋白為包被抗原的間接ELISA。P25蛋白是各種血清型RA間的共同抗原，所建立的ELISA可用于檢測(cè)不同血清型RA的感染。

1.6 免疫熒光技術(shù) 熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)。該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、敏感和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。檢測(cè)時(shí)取病料涂片、固定、然后進(jìn)行特異熒光染色、最后鏡檢，熒光著染的RA在黑暗的背景中呈橢圓形亮黃綠色環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌均不被熒光著染，整個(gè)視野暗淡、只隱約見到灰暗色的菌體［1］。該檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確的區(qū)分大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌。Marshe11最早報(bào)道了用該技術(shù)檢查患鴨組織或滲出物中的RA［1］。

免疫熒光技術(shù)檢測(cè)鴨疫里默氏菌病可分為直接熒光抗體技術(shù)和間接熒光抗體技術(shù)。郭玉璞等采用直接熒光抗體法來(lái)診斷急性病例。蘇敬良等［9］將間接熒光抗體技術(shù)用于急性死亡病例的檢測(cè)。朱琪等建立了間接免疫熒光抗體試驗(yàn)，對(duì)鴨疫里默氏菌病等進(jìn)行鑒別。張大丙等［1］的研究結(jié)果表明，直接和間接熒光抗體試驗(yàn)均無(wú)型特異性，卻均有種特異性，因此，都可用于菌種的鑒定，但在兩種試驗(yàn)中，都以同型抗原抗體之間出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而異型之間出現(xiàn)的熒光易衰減［1］。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

分子生物學(xué)檢測(cè)相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)。

2.1 PCR技術(shù) PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外95℃時(shí)解旋，35℃時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，再調(diào)溫度至65℃左右DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補(bǔ)鏈。RA的血清型十分復(fù)雜，目前全世界已報(bào)道的血清型有21個(gè)，不同血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù)作用。由于PCR方法并不針對(duì)病原菌的血清型，因此，能夠彌補(bǔ)血清型之間交叉反應(yīng)性低或沒(méi)有交叉反應(yīng)性的不足［10］。

胡清海等首先建立了PCR檢測(cè)鴨疫里默氏菌病的方法［11］。楊建遠(yuǎn)等［12］設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了鴨疫里默氏菌病的快速準(zhǔn)確的PCR檢測(cè)方法。其研究根據(jù)GenBank中25株鴨疫里默氏菌（RA）的外膜蛋A（OmpA）基因序列，在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，該P(yáng)CR檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確、可靠、快速、經(jīng)濟(jì)之優(yōu)點(diǎn)，可用于RA的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。曲豐發(fā)等［13］以16SrDNA為靶基因建立特異性PCR快速檢測(cè)鴨疫里默氏菌的方法具有較好的特異性和敏感性。覃宗華等［14］采用細(xì)菌16SrRNA基因的通用引物，用PCR方法擴(kuò)增出鴨疫里默氏菌的部分16SrRNA基因，同時(shí)利用生物軟件對(duì)Gen－Bank收錄的鴨疫里默氏菌和大腸桿菌16SrRNA基因序列進(jìn)行分析后，設(shè)計(jì)了鴨疫里默氏菌和大腸桿菌的種特異性引物，并據(jù)此建立了一種能快速準(zhǔn)確鑒別診斷鴨疫里默氏菌病和大腸桿菌病的雙重PCR方法。

PCR檢測(cè)除16SrRNA基因序列分析法和外膜蛋白分析法外，還有RFLP和REP-PCR分析法。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Rea1-Time Quantitative PCR）是近年發(fā)展起來(lái)的一種高敏感性檢測(cè)技術(shù)，它在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)放大檢測(cè)了信號(hào)，提高了檢測(cè)的敏感性；熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統(tǒng)的PCR相比，特異性大為提高；熒光定量PCR結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，無(wú)PCR后續(xù)操作步驟，降低產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)性，假陽(yáng)性結(jié)果幾率降低。熒光定量PCR分DNA熒光結(jié)合染料法和特異性熒光探針?lè)ǎ瑹晒馓结樂(lè)ㄌ禺愋暂^高。

段澤等［15］根據(jù)其實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的鴨疫里默氏菌（RA）莢膜多糖蛋白基因序（DQ151838），設(shè)計(jì)和合成熒光定量PCR引物和探針，建立了檢測(cè)RA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。可用于鴨疫里默氏菌感染的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查和鴨產(chǎn)品的檢疫等。

謝永平等［16］的研究根據(jù)GenBank登錄的鴨疫里默氏菌外膜蛋白（OmpA）基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物和探針，建立了直接檢測(cè)鴨疫里默氏菌的實(shí)時(shí)熒光定PCR快速方法。該方法應(yīng)用熱裂解法快速提取病料中RA中的DNA，與常規(guī)試劑提取方法比較，僅需30 min，縮短了DNA提取時(shí)間，應(yīng)用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)臨床樣品，完成檢測(cè)僅需2 h，與試劑提取DNA方法需要5 h比較，顯著縮短了檢測(cè)周期，為臨床診斷RA提供了快速檢測(cè)方法，適用于臨床鴨疫里默氏菌病的快速檢測(cè)。

馮金牛等［17］根據(jù)RA的16SrRNA基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，建立了檢測(cè)RA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法只對(duì)RA的DNA有陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，對(duì) E.coli、P.multocida、Salmonella均無(wú)特異性反應(yīng)。所建立的FQ-PCR方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)理想，具有較好的實(shí)用性，所建立方法的敏感性和特異性均高于普通PCR，且省時(shí)省力。

3 小結(jié)

鴨疫里默氏菌病是目前我國(guó)危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的傳染病之一，使我國(guó)養(yǎng)鴨戶遭受重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。以上是鴨疫里默氏菌病的檢測(cè)方法，各有特點(diǎn)，希望以后能有更多更好的檢測(cè)方法應(yīng)用于鴨疫里默氏菌病的檢測(cè)之中。

［1］ 張大丙，鄭獻(xiàn)進(jìn)，曲豐發(fā).鴨傳染性漿膜炎的診斷與防治技術(shù)［J］.中國(guó)家禽，2005，27（6）：46-52.

［2］ 高福，楊漢春，郭玉璞.第18屆世界家禽會(huì)議分組討論議會(huì)國(guó)際水禽生產(chǎn)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集［C］.北京，1988：261-262.

［3］ 張鶴曉，郭玉璞.間接ELISA檢測(cè)鴨疫里氏桿菌抗體的研究［J］.中國(guó)畜禽傳染病，1998，20（3）：183-186.

［4］ 蘇敬良，郭玉璞，呂艷麗.鴨疫里默氏桿菌免疫原性研究Ⅱ莢膜提取物免疫原性測(cè)定［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1998，24（8）：3-5.

［5］ 程龍飛，施少華.2型鴨疫里氏桿菌抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，21（2）：131-134.

［6］ 程安春，汪名書.簡(jiǎn)介酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)4型鴨疫里氏桿菌抗體的研究［J］.中國(guó)家禽，2004，26（16）：11-14.

［7］ HUANG B，SUBRAMANIAM S，F(xiàn)REY J，et a1.Vaccination of duckswith recombinant outer memb rane protein（Ompa）and a 41 Kda partia1 protein （P45N’）of Riemere11a anetipestife ［J］.Vet Microbio1，2002，84（3）：219-230.

［8］ 辜新貴，袁建豐，覃宗華，等.鴨疫里默氏桿菌重組蛋白P25間接ELISA檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2008（3）：218-223.

［9］蘇敬良，黃瑜，呂艷麗，等.間接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)鴨疫里氏桿菌［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1999，25（2）：12-13.

［11］ 張金靈，劉亞剛，吳皎，等.鴨傳染性漿膜炎研究進(jìn)展［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2006，32（4）：735-741.

［12］ 楊建遠(yuǎn)，鄧舜洲，何后軍.PCR法快速檢測(cè)鴨疫里氏桿菌的研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（3）：439-442.

［13］ 曲豐發(fā)，蔡暢，鄭獻(xiàn)，等.利用16SrDNA建立種特異性快速檢測(cè)鴨疫里默氏菌［J］.微生物學(xué)報(bào)，2006，46（1）：13-17.

［14］ 覃宗華，蔡建平，呂敏娜，等.鴨疫里默氏茵病和大腸桿菌病鑒別診斷雙重PCR方法的建立和應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（4）：517-521.

［15］ 段 澤，程安春，汪銘書，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌方法的建立和應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，44（2）：11-15.

［16］ 謝永平，盤寶進(jìn)，陳澤祥，等.鴨疫里默氏桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（10）：87-92.

［17］ 馮金牛，陳芳艷，晏永邦，等.鴨疫里默氏桿菌熒光定量PCR 檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（4）：392-396.