王會芹，郭 宏，趙 慧

心室重構(gòu)是引起心功能不全乃至心力衰竭的內(nèi)在原因[1]，以心肌肥厚、心肌細胞凋亡及某些細胞、非細胞成分(膠原纖維)的異常增加和心肌代謝及電生理的改變?yōu)樘卣?。心室重?gòu)影響患者的長期預后，而給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)等藥物尚不能充分抑制心室重構(gòu)。近期研究表明，高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)可獨立于動脈粥樣硬化，直接損傷心肌細胞，引起心室重構(gòu)[2-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)在多種心臟疾病的心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[5-7]。Chen等[8]臨床觀察發(fā)現(xiàn)老年人中HHcy患者與葉酸、維生素B6和維生素B12攝入量不足有關(guān)；Heinz等[9]、Glynn等[10]臨床研究表明補充充足的葉酸、維生素B6和維生素B12可有效降低HHcy患者血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平。然而鮮見有文獻研究補充該組維生素是否可以抑制HHcy所致的心室重構(gòu)。

本研究通過高蛋氨酸飲食喂養(yǎng)大鼠制造HHcy模型，同時給予葉酸、維生素B6和維生素B12降低血漿Hcy水平，觀察大鼠血漿Hcy水平降低的同時，心室的超聲學、病理組織學等是否改善，心肌細胞MMP-9的表達是否下降，以評價心室重構(gòu)是否改善，為補充葉酸、維生素B6和維生素B12抑制心室重構(gòu)提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠60只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔許可證號SCXK(京)2002-003〕，由哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～24 ℃，相對濕度(50±5)%，自然照明。體質(zhì)量(BW)為(200±50)g，采用隨機數(shù)字表，將大鼠隨機分為正常組(A組)、HHcy模型組(B組)、藥物干預組(C組)3組，各20只。A、B、C組大鼠BW分別為 (198±52)g、(202±53)g、(200±49)g。

1.2試劑Hcy試劑盒(美國雅培公司)；MMP-9放免分析試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Masson 3色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型制備A組大鼠喂食基礎(chǔ)飼料(全價顆粒飼料)，B組大鼠喂食蛋氨酸飼料(基礎(chǔ)飼料加1.7%蛋氨酸)，C組大鼠喂食蛋氨酸飼料加B族維生素(維生素B612 mg·kg-1·d-1、維生素B120.09 mg·kg-1·d-1、葉酸4 mg·kg-1·d-1)。各組大鼠自由進食飲水，連續(xù)喂食8周造模。喂食8周后，大鼠空腹6 h以上，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，開腹，暴露下腔靜脈。用5 ml注射器采靜脈血2 ml，置入EDTA抗凝管中，半小時內(nèi)3 000 r/min，離心10 min，取上層血漿-80 ℃保存，采用全自動化學發(fā)光法檢測Hcy水平，判斷大鼠造模是否成功。

1.3.2心臟彩超檢查大概喂食8周后，分別稱取BW及稱量包括室間隔在內(nèi)的左心室質(zhì)量(LVW)。將麻醉后的大鼠取仰臥位固定，胸前備皮，應(yīng)用探頭頻率為14 MHz的彩色多普勒超聲診斷儀進行心臟彩超檢查。取胸骨旁左心長軸切面和左心室乳頭肌短軸切面，圖像分析左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd)、左心室舒張末期后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVPWd)，計算左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection diameter，LVEF)、左心室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)，F(xiàn)S按如下公式計算：FS(%)=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100%。

1.3.3病理組織學和免疫組織化學檢查用鋒利雙面刀片沿左心室正中橫切，取約0.5 cm×0.5 cm的左室游離壁中段組織，放入4%預冷的多聚甲醛中前固定，再以15%乙醇甲醛液后固定，經(jīng)無水乙醇脫水、入蠟、包埋、機器切片5 μm、烘片后備用。冷凍切片蘇木素-伊紅(HE)染色檢查組織形態(tài)，顯微鏡下觀察心肌的變化、纖維組織增生情況。

心肌組織MMP-9免疫組化染色：取各組動物心肌石蠟切片，脫蠟、水化組織切片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照；3%過氧化氫孵育5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化氫物酶；復合消化酶消化(胰酶消化)，室溫10 min；分別滴加一抗抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3；滴加通用型IgG抗體(Fab段)-HRP多聚體，室溫或37 ℃孵育10 min，PBS沖洗5 min×3；DAB溶液顯色；蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片。用計算機病理圖像分析系統(tǒng)的組化分析系統(tǒng)模塊進行圖像分析，計算MMP-9表達的陽性目標面密度(scale value，Sv)。

1.3.4心肌組織Masson 3色染色切片脫蠟處理至水；滴加1滴(100 μl)Masson復合染色液染色5 min。蒸餾水沖掉染液；滴加1滴(100 μl)磷鉬酸染色5 min，甩干；直接滴加1滴(100 μl)苯胺藍染色5 min蒸餾水稍沖；滴加1滴(100 μl)分化液分化30～60 s(2次)；95%乙醇、無水乙醇脫水，透明，封固。Masson 3色染色中膠原纖維呈藍綠色，變性纖維泛白色，肌細胞呈紅色。用計算機病理圖像分析系統(tǒng)的組化分析系統(tǒng)模塊進行圖像分析，計算心肌膠原纖維的陽性目標Sv。

2　結(jié)果

2.1血漿Hcy水平比較大鼠喂食8周后，A組大鼠血漿Hcy水平為(9.2±0.9)μmol/L，B組為(39.2±2.1)μmol/L，C組為(11.2±1.3)μmol/L。3組大鼠血漿Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=11.52，P=0.003)；其中A組、C組大鼠血漿Hcy水平與B組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2大鼠LVW及LVW/BW于實驗前及實驗8周后，測定每組7只大鼠的LVW及BW。實驗前，3組大鼠BW、LVW、LVW/BW比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗8周后，3組大鼠BW、LVW、LVW/BW比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中B組、C組大鼠LVW/BW與A組比較，C組大鼠LVW/BW與B組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表1)。

2.3大鼠心功能測定實驗8周后，分別檢測3組大鼠的心功能。結(jié)果顯示，3組大鼠EF、LVEDd、LVPWd、FS比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中B、C組大鼠上述4項指標與A組比較，C組大鼠上述4項指標與B組比較，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表2)。

2.4心肌病理組織學和免疫組織化學檢查結(jié)果

2.4.1心肌病理組織學改變光鏡下：A組肌細胞排列有序、肌纖維結(jié)構(gòu)正常，為正常心肌組織；B組心肌組織發(fā)生纖維化，肌纖維排列紊亂；C組大部分心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，但部分心肌仍可見輕度纖維化(見圖1)。與A組比較，B組心肌病理組織學改變明顯減輕。

表1　實驗前及實驗8周后3組大鼠BW、LVW及LVW/BW的比較

注：BW=體質(zhì)量，LVW=左心室質(zhì)量；與A組比較，*P<0.01；與B組比較，△P<0.01

圖1　3組大鼠心肌HE染色光鏡下病理組織學改變(×200)

Table2Comparison of echocardiography data in the three groups 8 weeks after experiment

組別只數(shù)EF(%)LVEDd(mm)LVPWd(mm)FS(%)A組782±4 4.90±0.24 2.37±0.05 44.47±2.06 B組767±4* 6.86±0.44* 2.18±0.04* 30.66±2.52* C組774±6*△5.68±0.49*△2.29±0.05*△37.50±2.90*△F值12.5610.9311.3213.72P值0.0050.0090.0080.003

注：EF=射血分數(shù)，LVEDd=左室舒張末期內(nèi)徑，LVPWd=左室舒張末期后壁厚度，F(xiàn)S=左室短軸縮短率；與A組比較，*P<0.01；與B組比較，△P<0.01

2.4.2免疫組化法測定心肌組織MMP-9的表達MMP-9陽性細胞在心肌細胞中呈深棕色。實驗8周后，A、B、C組大鼠心肌MMP-9的表達分別為(0.0508±0.0067)、(0.1373±0.0204)和(0.0970±0.0218)，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=12.23，P=0.006)；B、C組大鼠心肌MMP-9的表達與A組比較，C組大鼠心肌MMP-9的表達與B組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖2)。

2.5大鼠心肌組織Masson 3色染色結(jié)果Masson 3色染色中膠原纖維呈藍綠色，變性纖維泛白色，肌細胞呈紅色。于實驗8周后，經(jīng)心肌膠原纖維Masson 3色染色半定量分析，A、B、C組大鼠心肌膠原纖維陽性目標Sv分別為(0.5107±0.0764)、(6.9070±0.9103)和(2.8026±0.7052)，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=12.23，P=0.006)；其中B組、C組大鼠心肌膠原纖維陽性目標Sv與A組比較，C組與B組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖3)。

3　討論

確認動物模型的建立是動物實驗的首要條件之一。以往研究表明高蛋氨酸飲食負荷方法可以制造HHcy的模型[11-12]。本研究顯示，用1.7%蛋氨酸飲食喂養(yǎng)大鼠，發(fā)現(xiàn)8周后大鼠血漿Hcy水平較正常大鼠顯著增高，證實造模方法可靠。

Nasir等[13]通過對6 814例無癥狀HHcy患者的研究發(fā)現(xiàn)，Hcy水平升高與利用磁共振加權(quán)成像檢測到的左心室局部功能收縮功能減低相關(guān)。Guéant-Rodriguez等[14]通過對冠狀動脈造影未發(fā)現(xiàn)冠狀動脈明顯病變的709例患者觀察，發(fā)現(xiàn)Hcy水平升高與左心室功能障礙、EF降低有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HHcy大鼠LVW/BW較正常大鼠顯著升高，而進行葉酸、維生素B6和維生B12治療的大鼠LVW/BW則較HHcy大鼠顯著降低。同時，心臟彩超檢查顯示HHcy大鼠LVEDd增大，左心室后壁變薄，EF降低；而葉酸、維生素B6和維生B12治療的大鼠LVEDd則較HHcy大鼠顯著降低，EF、LVPWd、FS較HHcy大鼠顯著升高?？梢?，葉酸、維生素B6和維生B12能改善HHcy大鼠心室功能障礙，為心功能不全提供新的治療途徑。

注：與A組比較，*P<0.01；與B組比較，△P<0.01

圖23組大鼠心肌組織MMP-9的表達結(jié)果

Figure2MMP-9 expressions in myocardial tissues of three different groups

注：與A組比較，*P<0.01；與B組比較，△P<0.01

圖3各組心肌Masson 3色染色膠原纖維定量

Figure3Collagen fiber quantification in myocardium staining with Masson 3-color

MMP-9是降解細胞外基質(zhì)的鋅依賴蛋白酶，有研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[5-7]。本研究應(yīng)用免疫組織化學檢測觀察心肌MMP-9的表達，結(jié)果顯示HHcy大鼠心肌MMP-9的表達較正常大鼠顯著增高，同時Masson 3色染色半定量顯示心肌膠原纖維化較正常大鼠增加；而葉酸、維生素B6和維生B12治療的大鼠心肌MMP-9的表達較HHcy大鼠顯著降低，心肌膠原纖維化較HHcy大鼠降低。說明高Hcy增加心肌細胞MMP-9的表達，引起心肌纖維化，從而導致心室重構(gòu)。Ducharme等[15]發(fā)現(xiàn)MMP-9基因缺失可減小實驗性大鼠心肌梗死后至少15 d內(nèi)的左心室腔擴張程度，同時也證實了MMP-9基因缺陷大鼠心肌梗死后左心室擴張的受限現(xiàn)象，伴隨有炎癥反應(yīng)的減弱，膠原沉積的減少，梗死愈合的延遲。Moshal等[16]通過實驗發(fā)現(xiàn)MMP-9基因的缺失能降低心力衰竭時心肌組織的收縮功能不全。其具體機制尚不清楚，需要進一步研究。

葉酸作為體內(nèi)甲基的間接供體，維生素B6作為胱硫醚-β-合成酶及胱硫醚的輔酶，維生素B12作為蛋氨酸合成酶的輔酶，均影響體內(nèi)Hcy的代謝。葉酸、維生素B6、維生素B12作為Hcy代謝過程中的重要調(diào)節(jié)因子，影響著體內(nèi)Hcy的水平。Waskiewicz等[17]通過對20～74歲的人群隨機抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，葉酸、維生素B6、維生素B12與血漿Hcy水平呈反向趨勢變化，葉酸、維生素B6、維生素B12攝入不足可以導致血漿Hcy升高，而補充適量葉酸、維生素B6、維生素B12可以降低血漿Hcy水平。本研究也發(fā)現(xiàn)葉酸、維生素B6和維生素B12可有效降低Hcy水平，同時還可以減少心臟LVEDd，改善心室EF，降低心肌MMP-9的表達，減輕心肌纖維化程度，改善心室重構(gòu)。

目前，國內(nèi)外已有研究表明高Hcy能夠影響心室重構(gòu)和心臟功能，但其機制目前尚不清楚。體外研究證明Hcy可使心肌細胞凋亡壞死，其主要機制是活性氧自由基(Ros)的產(chǎn)生及核氮氧化物表達增加[18]。也有研究表明Hcy可以通過在H9C2心肌細胞內(nèi)產(chǎn)生過氧亞硝基陰離子，并活化心肌細胞內(nèi)兩種主要激酶〔細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和氨基端激酶(JNK)〕，促進細胞凋亡[19]。Dong等[20]研究顯示Hcy可通過NADPH氧化酶和(或)SAPK/JNK途徑誘導細胞氧化應(yīng)激，促進細胞凋亡。此外，升高的Hcy引起細胞核p47phox表達，使核活性氧自由基的產(chǎn)生增多，促進細胞凋亡[21]。本實驗證明Hcy可以通過增加心肌MMP-9的表達，促進心肌纖維化，導致心室重構(gòu)。但是Hcy是如何激活MMP-9并通過何種機制參與心肌纖維化并導致心室重構(gòu)值得深入研究。

總之，HHcy時LVEDd增大，EF下降，LVW/BW、心肌MMP-9表達量、心肌膠原纖維化增加，心室重構(gòu)；而葉酸、維生素B6和維生素B12可以有效降低血漿Hcy水平，同時可以改善HHcy引起的心肌纖維化，減少心室重構(gòu)過程中起重要作用的MMP-9的表達，延緩心室重構(gòu)。這一發(fā)現(xiàn)可能為HHcy的一級預防提供了新方法。但本研究并未進行葉酸、維生素B6維生素B12的分組分析，未能證明各種維生素各自的作用及作用機制，尚待進一步研究。

1Konstam MA，Kramer DG，Patel AR，et al.Left ventricular remodeling in heart failure[J].J Am Coll Cardiol Img，2011，4(1)：98-108.

2Bai YP，Liu YH，Chen J，et al.Rosiglitazone attenuates NF-kappaB-dependent ICAM-1 and TNF-alpha production caused by homocysteine via inhibiting ERK1/2/p38MAPK activation[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，360(1)：20-26.

3Walker E，Black J，Parris C，et al.Effect of experimental hyperhomocysteinemia on cardiac structrue and function in the rat[J].Ann Clin Lab Sci，2004，34(2)：175-180.

4Sipkens JA，Krijnen PA，Meischl C，et al.Homocysteine affects cardiomyocyte viability：concentration-dependent effects on reversible flip-flop，apoptosis and necrosi[J].Apoptosis，2007，12(8)：1407-1418.

5Hansson J，Lind L，Hulthe J，et al.Relations of serum MMP-9 and TIMP-1 levels to left ventricular measures and cardiovascular risk factors：a population-based study[J].Eur J Cardiovasc Prev Rehabil，2009，16(3)：297-303.

6Matsumoto Y，Park IK，Kohyama K.Matrix metalloproteinase(MMP)-9，but not MMP-2，is involved in the development and progression of C protein-Induced myocarditis and subsequent dilated cardiomyopathy[J].J Immunol，2009，183(7)：4773-4781.

7Zile MR，DeSantis SM，Baicu CF，et al.Plasma biomarkers that reflect determinants of matrix composition identify the presence of left ventricular hypertrophy and diastolic heart failure[J].Circ Heart Fail，2011，4(3)：246-256.

8Chen HC，Chen KJ，Wang CH，et al.Association of B vitamins status and homocysteine levels in elderly Taiwanese[J].Asia Pac J Clin Nutr，2005，14(3)：250-255.

9Heinz J，Kropf S，Domr?se U，et al.B vitamins and the risk of total mortality and cardiovascular disease in end-stage renal disease：results of a randomized controlled trial[J].Circulation，2010，121(12)：1432-1438.

10Glynn RJ，Manson JE，Christen WG，et al.Effect of folic acid and B vitamins on the occurrence of venous thromboembolism：a randomized trial in women at high cardiovascular risk[J].Circulation，2008，118：S1137-S1143.

11Dayal S，Lentz SR.Murine models of hyperhomocysteinemia and their vascular phenotypes[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(9)：1596-1605.

12Zhou Ji，Werstuck GH，Lhoták S，et al.Hyperhomocysteinemia induced by methionine supplementation does not independently cause atherosclerosis in C57BL/6J mice[J].FASEB J，2008，22(7)：2569-2578.

13Nasir K，Tsai M，Rosen BD，et al.Elevated homocysteine is associated with reduced regional left ventricular function：the multi-ethnic study of atherosclerosis[J].Circulation，2007，115(2)：180-187.

14Guéant-Rodriguez RM，Juillière Y，Nippert M，et al.Left ventricular systolic dysfunction is an independent predictor of homocysteine in angiographically documented patients with or without coronary artery lesions[J].J THromb Haemost，2007，5(6)：1209-1216.

15Ducharme A，F(xiàn)rantz S，Aikawa M，et al.Targeted deletion of matrix metalloproteinase-9 attenuates left ventricular enlargement and collagen accumulation after experimental myocardial infarction[J].J Clin Invest，2000，106(1)：55-62.

16Moshal KS，Rodriguez WE，Sen U，et al.Targeted deletion of MMP-9 attenuates myocardial contractile dysfunction in heart failure[J].Physiol Res，2008，57(3)：379-384.

17Waskiewicz A，Sygnowska E，Broda G.Dietary intake of vitamins B6，B12and folate in relation to homocysteine serum concentration in the adult Polish population-WOBASZ project[J].Kardiol Pol，2010，68(3)：275-282.

18Sipkens JA，Krijnen PA，Meischl C，et al.Homocysteine affects cardiomyocyte viability：concentration-dependent effects on reversible flip-flop，apoptosis and necrosis[J].Apoptosis，2007，12(8)：1407-1418.

19Levrand S，Pacher P，Pesse P，et al.Homocysteine induces cell death in H9C2 cardiomyocytes through the generation of peroxynitrite[J].Biochem Biophys Res Commum，2007，359(3)：445-450.

20Dong F，Zhang X，Li SY，et al.Possible involvement of NADPH oxidase and JNK in homocysteine induced oxidative stress and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells[J].Cardiovascular Toxicol，2005，5(1)：9-20.

21Sipkens JA，Krijnen PA，Hahn NE，et al.Homocysteine-induced cardiomyocyte apoptosis and plasma membrane flip-flop are independent of S-adenosylhomocysteine：a crucial role for nuclear p47(phox)[J].Mol Cell Biochem，2011，358(1/2)：229-239.