劉江月，張代娟，王建英，劉同美，郭軍堂，侯建平

隨著人們物質(zhì)生活水平的改善，2型糖尿病(T2DM)已成為老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病，糖尿病引起的大血管病變?nèi)绻跔顒?dòng)脈性心臟病、腦血管病及周圍血管病已成為糖尿病患者致死、致殘的主要問(wèn)題。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是T2DM常見(jiàn)的伴發(fā)病之一。T2DM伴AS的病死率較非T2DM的AS高1倍。故探討T2DM伴大血管病變的發(fā)生機(jī)制對(duì)于患者的治療有著重要的意義。越來(lái)越多的證據(jù)揭示，鐵代謝和糖代謝之間存在相互影響，二者的關(guān)系可能是雙向的，即鐵代謝異?？梢杂绊懱谴x；而長(zhǎng)期高血糖又可損傷鐵代謝[1]。鐵儲(chǔ)存的增加預(yù)示著T2DM的發(fā)生，鐵誘導(dǎo)的損傷還會(huì)影響到糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。本研究通過(guò)觀察T2DM大鼠血管并發(fā)癥發(fā)生情況、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)和其他相關(guān)代謝指標(biāo)改變情況，探討降糖調(diào)脂靈對(duì)T2DM大血管病變的保護(hù)作用，為糖尿病血管并發(fā)癥的臨床防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性Wistar大鼠60只，清潔級(jí)，日齡30～50 d，體質(zhì)量160～180 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK魯20090017。

1.1.2主要試劑鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)；胰島素放免試劑盒(北京原子高科技術(shù)股份有限公司)；血糖試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品)；糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)試盒(美國(guó)Bio公司)；TfR多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)；可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法試劑盒(美國(guó)BPB生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn))。

1.1.3中藥制備降糖調(diào)脂靈由西洋參、枸杞子、山楂片、天花粉、知母、生地、葛根、澤瀉、麥冬、石斛、玉竹、刺五加、何首烏13味藥組成。由濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室制備，經(jīng)水煎、過(guò)濾、濃縮，制備成150%(每ml含生藥1.5 g)濃縮液，分裝成300 ml備用，為成人劑量的6.25倍。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型建立取10只大鼠作為對(duì)照組，喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料(糖類占53%，蛋白質(zhì)占23%，脂肪占5%)，不做其他任何處理。另取50只大鼠以自制高糖高脂飼料(糖類占48%，脂肪占22%，蛋白質(zhì)占20%)喂養(yǎng)1個(gè)月誘導(dǎo)胰島素抵抗后，按25 mg/kg腹腔注射STZ誘發(fā)糖尿病，72 h后測(cè)量尾靜脈血糖，血糖>16.7 mmol/L為建模成功標(biāo)準(zhǔn)。選取血糖>16.7 mmol/L的大鼠30只，隨機(jī)分為模型組、雙胍組、中藥組，各10只，繼續(xù)喂以高糖高脂飼料；同時(shí)，雙胍組大鼠給予二甲雙胍134 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥組大鼠給予降糖調(diào)脂靈690 mg·kg-1·d-1灌胃，而對(duì)照組和模型組大鼠則給予相當(dāng)量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)各組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)最后1 d禁食12 h，然后腹腔注射3%戊巴比妥鈉1 ml/kg麻醉固定，然后快速由頸總動(dòng)脈取血4～5 ml，室溫靜置20 min后，離心10 min(2 000 r/min)，分離血清，檢測(cè)血糖、HbA1c(采用微柱親和層析法測(cè)定)、胰島素(采用放射免疫法檢測(cè))、血脂〔總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)〕及sTfR水平(ELISA法)；計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)(ISI)。同時(shí)取主動(dòng)脈壁，一部分放入凍存管投入液氮保存，以備檢測(cè)TfR mRNA表達(dá)；另一部分立即置于4 ℃預(yù)冷的5%戊二醛溶液中固定，以備電鏡觀察。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組大鼠毛色光澤，活動(dòng)自如，活潑，飲食正常；模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，皮下脂肪厚，但隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，毛色暗淡，活動(dòng)減少，精神狀態(tài)較差，進(jìn)食量減少；雙胍組和中藥組大鼠毛色、活動(dòng)、精神狀態(tài)明顯好于模型組大鼠。

2.2各組大鼠血糖、HbA1c、胰島素及ISI比較4組大鼠血糖、HbA1c、胰島素水平及ISI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組大鼠上述4項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙胍組、中藥組大鼠血糖、HbA1c水平及ISI與模型組比較，中藥組胰島素水平與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.3各組大鼠血脂水平比較4組大鼠血脂(TC、TG、HDL、LDL)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組大鼠TC、LDL、HDL、TG水平與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙胍組大鼠血脂指標(biāo)與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而中藥組大鼠LDL、HDL、TG水平與模型組比較，TC、TG水平與雙胍組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

Table1Comparison of BS，HbA1c，INS，ISI in serum between each group

組別只數(shù)血糖(mmol/L)HbA1c(%)胰島素(mmol/L)ISI對(duì)照組10 5.3±0.6 5.1±0.7 15.8±3.7 -3.05±0.61 模型組1020.2±0.7*20.8±1.2*59.7±16.3*-5.40±0.36*雙胍組1011.4±0.6△10.2±0.8△53.7±11.8 -4.82±0.95△中藥組1012.6±1.0△12.0±1.6△43.2±17.5△-4.53±0.54△F值637.42435.4420.8428.02P值<0.01<0.01<0.01<0.01

注：HbA1c=糖化血紅蛋白，ISI=胰島素敏感性指數(shù)；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表2　各組大鼠血脂水平的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與雙胍組比較，☆P<0.05

2.4各組大鼠血清sTfR水平及主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá)量比較4組大鼠血清sTfR水平及主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組、雙胍組、中藥組大鼠血清sTfR水平及TfR mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙胍組大鼠sTfR水平及TfR mRNA表達(dá)量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而中藥組大鼠血清sTfR水平及TfR mRNA表達(dá)量與模型組、雙胍組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表3、圖1)。

2.5各組大鼠主動(dòng)脈弓動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞可見(jiàn)染色質(zhì)成團(tuán)塊狀分布，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞器粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和線粒體形態(tài)、大小均正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)富含核糖體。而模型組大鼠可見(jiàn)主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞核內(nèi)電子密度明顯升高，異染色質(zhì)增多，各種細(xì)胞器破壞，線粒體空泡樣變、明顯嵴斷裂，大空泡出現(xiàn)的高爾基復(fù)合體。雙胍組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞也出現(xiàn)類似變化。中藥組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞僅出現(xiàn)輕微損壞，少量平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞器呈現(xiàn)退行性改變，可見(jiàn)少量線粒體空泡變、髓鞘樣變和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)空泡變(見(jiàn)圖2～5)。

Table3Comparision of the level of sTfR in serum and the experession of TfR mRNA on aortic smooth muscle cell

組別只數(shù)sTfR(mg/L) TfRmRNA 對(duì)照組102.92±0.75 0.31±0.15 模型組104.25±0.18* 0.86±0.14* 雙胍組104.06±0.24* 0.78±0.23* 中藥組103.36±0.38△▲☆0.52±0.18△▲☆F值43.0419.81P值<0.01<0.01

注：sTfR=可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，TfR=轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；與對(duì)照組比較，*P<0.01，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.01；與雙胍組比較，☆P<0.01

圖1　RT-PCR后各組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá)電泳圖

Figure1RT-PCR electrophoresis map of the expression of TfR mRNA on aortic smooth muscle cell

3　討論

近年來(lái)Brownlee[2]提出，高血糖致內(nèi)皮細(xì)胞線粒體活性氧簇(ROS)生成增加是糖尿病伴血管病變發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素。而鐵是體內(nèi)最重要的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)促進(jìn)劑，可啟動(dòng)或催化Haber-Weiss反應(yīng)，產(chǎn)生ROS，并能使低活性自由基轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚宰杂苫貏e是通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基。高活性自由基及其他氧化產(chǎn)物是損傷血管舒張及引起內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)生性抗氧化劑缺失的主要因子。同時(shí)鐵和ROS可作為生長(zhǎng)因子促進(jìn)血管平滑肌增生，在動(dòng)脈硬化粥樣斑塊形成過(guò)程中，鐵蛋白基因表達(dá)是提高的[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，AS的動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞質(zhì)含鐵量明顯高于非AS組織，且鐵沉積量與AS程度直接相關(guān)[4]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞異常改變，核內(nèi)電子密度升高，異染色質(zhì)增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量線粒體出現(xiàn)明顯的嵴斷裂、空泡樣變、髓鞘樣變，高爾基復(fù)合體內(nèi)出現(xiàn)大空泡；同時(shí)，模型組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加，加上模型組大鼠血糖、HbA1c水平亦較對(duì)照組顯著增高，提示T2DM大鼠大血管病變可能與TfR mRNA高表達(dá)有關(guān)，而TfR mRNA高表達(dá)與高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加及氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。因此推測(cè)T2DM伴大血管病變可能與高糖導(dǎo)致的鐵代謝紊亂有關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)中藥組大鼠降糖調(diào)脂靈治療后血糖、HbA1c、sTfR水平及主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá)量均較模型組顯著降低；電鏡結(jié)果表明降糖調(diào)脂靈治療后大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞損壞輕微。故認(rèn)為降糖調(diào)脂靈對(duì)T2DM伴大血管病變具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低血糖、改善體內(nèi)的高糖狀態(tài)從而調(diào)整鐵代謝紊亂。

圖2對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)圖片

Figure2Picture of smooth muscle cell electron microscope ultrastructure in control group

圖3模型組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)圖片

Figure3Picture of smooth muscle cell electron microscope ultrastructure in model group

圖4雙胍組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)圖片

Figure4Picture of smooth muscle cell electron microscope ultrastructure in metformin group

圖5中藥組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)圖片

Figure5Picture of smooth muscle cell electron microscope ultrastructure in TCM group

胰島素是一種合成激素，它刺激細(xì)胞攝取許多營(yíng)養(yǎng)素。胰島素促進(jìn)腸道吸收非血紅素鐵，這是與人體的需求緊密相關(guān)的，當(dāng)人體內(nèi)總鐵儲(chǔ)存正常時(shí)對(duì)非血紅素鐵鐵的攝取量很小。胰島素也促進(jìn)腸道血紅素鐵的吸收，但血紅素鐵的吸收卻不依賴于總鐵含量。生理穩(wěn)態(tài)下，循環(huán)鐵是通過(guò)特異性的具有高親和力的TfR受體從血液中吸收的，繼而與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合在一起形成TfR復(fù)合物，該復(fù)合物被吞入細(xì)胞后，釋放進(jìn)入一個(gè)無(wú)酸性的細(xì)胞間隔中并被消化，轉(zhuǎn)化成為細(xì)胞基本的組成成分。胰島素還可以顯著加速脂肪細(xì)胞對(duì)鐵的攝取，將TfR復(fù)合物由細(xì)胞內(nèi)膜間隔重新分布到細(xì)胞表面，從而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)鐵的攝取，致使細(xì)胞內(nèi)鐵超負(fù)荷。在對(duì)鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，胰島素也影響鐵蛋白的合成[5]。更為重要的是，胰島素敏感的葡萄糖載體和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體在TfR的作用下于微粒體膜上聚集，這就意味著胰島素對(duì)鐵的攝取的調(diào)節(jié)與其葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)存在著關(guān)聯(lián)。相反，鐵也影響著胰島素的功能。鐵干擾胰島素限制肝糖輸出的作用。鐵負(fù)荷增加可以抑制肝臟攝取和清除胰島素，干擾胰島素對(duì)肝糖原異生的抑制作用，造成循環(huán)中高胰島素血癥[6]。這樣，胰島素與鐵潛在的相互作用形成惡性循環(huán)，加重胰島素抵抗和誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰島素、sTfR水平較對(duì)照組顯著升高，與以往的結(jié)論一致[5-6]。提示高胰島素血癥可能導(dǎo)致鐵代謝紊亂，T2DM大鼠大血管病變可能與高胰島素血癥導(dǎo)致鐵代謝紊亂有關(guān)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)降糖調(diào)脂靈治療后中藥組大鼠胰島素、sTfR水平及主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá)量較模型組顯著降低，電鏡結(jié)果表明降糖調(diào)脂靈治療的大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞損壞輕微。故認(rèn)為降糖調(diào)脂靈對(duì)T2DM大血管病變具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)改善體內(nèi)的高胰島素狀態(tài)從而調(diào)整鐵代謝紊亂。

綜上所述，T2DM大血管病變與鐵代謝紊亂有密切關(guān)系，T2DM高糖、高胰島素血癥可能導(dǎo)致鐵代謝紊亂，促進(jìn)大血管病變的發(fā)生；降糖調(diào)脂靈對(duì)T2DM大血管病變具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其降低血糖、血脂，從而改善鐵代謝紊亂有關(guān)。

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3Wu EX，Kim D，Tosti CL，et al.Magnetic resonance assessment of iron overload by separate measurement of tissue ferritin and hemosiderin iron[J].Ann N Y Acad Sci，2010，1202(8)：115-122.

4Vlasakova Z，Pelikanova T，Kazadova L，et al.Serum ferritin，oxidation and risk factors for atherogenes in healthy of spring of hypertensive patients[J].Vnitr Lek，2002，48(2)：105-111.

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6賈悅，董凌燕.鐵元素在糖尿病中的作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2004，31(5)：201.