劉保魁，楊玉秀，韓雙印，張立達(dá)，白陽(yáng)秋，房新輝

肝癌是我國(guó)常見的腫瘤之一，起病隱匿，惡性程度高，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，因此肝癌的早期診斷至關(guān)重要。甲胎蛋白(AFP)是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的診斷肝癌的腫瘤標(biāo)志物，但是，仍然有30%～40%的肝癌患者AFP水平在參考范圍內(nèi)[1]。所以，尋求一種新的腫瘤標(biāo)志物或聯(lián)合各種腫瘤標(biāo)志物診斷肝癌成為一種重要策略。硫氧還蛋白(TRX)是一類分布廣泛的小分子量多功能蛋白，其含有兩個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基活性位點(diǎn)，該活性中心可催化許多氧化還原反應(yīng)[2]。在生理?xiàng)l件下，TRX參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、抗氧化應(yīng)激、調(diào)控細(xì)胞凋亡等[3]。另外，許多研究表明TRX參與不同腫瘤及其他病變的發(fā)生和發(fā)展[4]。然而，有關(guān)血漿TRX用于診斷肝癌的研究并不多見。本研究應(yīng)用ELISA法檢測(cè)TRX在肝癌患者血漿中的表達(dá)并評(píng)估其診斷肝癌的價(jià)值。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2012年5—9月河南省人民醫(yī)院肝膽外科住院的肝癌患者90例(肝癌組)，其中男50例，女40例；年齡32～75歲，平均(50.2±10.5)歲。均經(jīng)病理檢查證實(shí)為肝癌，術(shù)前均未進(jìn)行放療及化療。臨床分期根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟的TNM系統(tǒng)分期法劃分。選擇同期河南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科肝硬化患者40例(肝硬化組)，其中男25例，女15例；年齡35～70歲，平均(45.0±9.5)歲。選擇同期35例同年齡段健康體檢者(對(duì)照組)，其中男25例，女10例；平均(42.0±7.3)歲。

1.2標(biāo)本采集抽取清晨空腹靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝的無(wú)菌試管中，室溫3 500 r/min離心15 min，收集血漿置于-80 ℃保存待測(cè)定。

1.3ELISA檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。主要檢測(cè)儀器為BIO-RAD680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，于450 nm處測(cè)吸光度(OD)，讀取OD值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用Excel 2007(微軟公司)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過已知標(biāo)準(zhǔn)品水平值計(jì)算樣品水平值。每1個(gè)血漿樣品測(cè)2次求平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。因AFP和TRX水平均不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)〔M(QR)〕表示。組間比較采用Mann-Whitney 或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用非參數(shù)Spearman檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析AFP和TRX診斷肝癌的敏感度和特異度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AFP和TRX水平比較肝癌組患者血漿中AFP和TRX水平均高于肝硬化組和對(duì)照組，肝硬化組AFP水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝硬化組TRX水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1　3組受檢者血漿AFP和TRX水平比較〔M(QR)，μg/L〕

注：與肝癌組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，△P>0.05；與對(duì)照組比較，▲P<0.05

2.2肝癌患者AFP和TRX水平的相關(guān)性分析將肝癌患者血漿TRX水平與AFP水平進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示TRX水平與AFP水平無(wú)直線相關(guān)性(r=-0.06,P=0.560)。

2.3肝癌患者血漿TRX與臨床特征關(guān)系不同年齡、性別、肝炎病毒感染狀態(tài)、腫瘤大小、腫瘤組織分化程度及TNM分期的肝癌患者血漿中TRX的水平間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.4TRX和AFP對(duì)于診斷肝癌價(jià)值的比較ROC曲線分析顯示，TRX的ROC曲線下面積為0.840,95%可信區(qū)間為(0.775，0.892)。最佳臨界值為33.0 μg/L，其敏感度為74.4%，特異度為77.3%。不同臨界值TRX的敏感度和特異度見表3。AFP的ROC曲線下面積為0.796，95%可信區(qū)間為(0.727，0.855)。最佳臨界值為61.0 μg/L,敏感度為56.67%，特異度為80.33%(見圖1)。

2.5TRX和AFP聯(lián)合診斷肝癌的價(jià)值90例肝癌患者血漿TRX陽(yáng)性50例，陽(yáng)性率55.6%，AFP陽(yáng)性例數(shù)30例，陽(yáng)性率33.3%；TRX聯(lián)合AFP檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)65例，陽(yáng)性率72.3%。

表2肝癌患者血漿TRX水平與臨床特征之間的關(guān)系(μg/L)

Table2Relationship between plasma TRX levels with clinical parameters of HCC patients

例數(shù)中位數(shù)四分位數(shù)間距Z(H)值P值年齡(歲)-0 88?0 376　≤503854 6771 42　>505244 0962 78性別-1 57?0 116　男性5055 5061 35　女性4043 0577 28肝炎病毒感染狀態(tài)-0 90?0 371　乙型肝炎病毒5154 6759 30　丙型肝炎病毒3944 0946 04腫瘤大小(cm)-0 20?0 837　≤54852 2058 78　>54246 0570 24組織分化程度0 0870 958　高分化3145 0158 22　中分化3446 0565 39　低分化2555 0147 23TNM分期0 3430 754?、?Ⅱ3447 5460 54　Ⅲ3244 9558 89?、?460 4070 01

注：*為Z值

表3不同臨界值TRX對(duì)肝癌的診斷價(jià)值(%)

Table3Diagnostic values of plasma TRX at different cut-off values determined by ROC curve

臨界值(μg/L)敏感度特異度陽(yáng)性預(yù)測(cè)值陰性預(yù)測(cè)值　16 0　91 1148 0067 881 8　33 0　74 4477 3379 871 6120 030 0098 6796 454 0

圖1　AFP和TRX診斷肝癌的ROC曲線

Figure1ROC curve of AFP and TRX for diagnosis of hepatocellular carcinoma

3　討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段及多基因相互作用的過程[5]。其起病隱匿，惡性程度高，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，而且其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。因此肝癌的早期診斷仍是肝癌診治研究的熱點(diǎn)之一。AFP是目前臨床上診斷肝癌應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物，但是，其敏感度和特異度不高。尋求新的腫瘤標(biāo)志物勢(shì)在必行。

TRX是一種相對(duì)分子量為12 kDa的緊密球形蛋白，于1964年首次在大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)，是核糖核酸還原酶的供氫體[6]。TRX氨基序列中含有1個(gè)氧化還原活性的Cys-Gly-Pro-Cys氨基酸序列，該活性中心可催化許多氧化還原反應(yīng)[7]。在生理?xiàng)l件下，TRX參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、抗氧化應(yīng)激、調(diào)控細(xì)胞凋亡等。最近許多研究表明TRX在各種腫瘤患者組織中高表達(dá)，如乳腺癌[8]、宮頸癌[9]、胃癌[10]和肝癌[11]等。而許多研究也證明血清TRX可以作為急性胰腺炎[12]、哮喘[13]、腹膜惡性間皮瘤[14]等多種疾病的標(biāo)志物。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)血清TRX水平在肝癌患者中增高[15]，但其臨床診斷價(jià)值并沒有深入研究。本研究應(yīng)用ELISA法檢測(cè)TRX在肝癌患者血漿中的水平并評(píng)估了其診斷肝癌的價(jià)值，研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血漿TRX水平明顯高于肝硬化組和對(duì)照組。這說(shuō)明TRX在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，并提示血漿TRX可能成為肝癌的腫瘤標(biāo)志物，這和Yamada等[13]的發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。研究認(rèn)為細(xì)胞在氧化應(yīng)激時(shí)會(huì)向血液中釋放TRX[16]；另外也有研究表明在一些癌組織中血清TRX水平增高，但切除癌組織后血清中的TRX水平又會(huì)下降[15],這說(shuō)明腫瘤患者血清中的TRX是由腫瘤組織分泌的。本研究中肝癌患者血漿TRX水平增高可能來(lái)源于乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染造成的氧化應(yīng)激和腫瘤組織自身釋放所致。

ROC曲線分析表明TRX診斷肝癌的最佳臨界值為33.0 μg/L，其敏感度為74.4%，特異度為77.3%。肝癌患者血漿TRX水平與AFP水平無(wú)明顯直線相關(guān)性，這表明AFP陰性肝癌患者可能TRX陽(yáng)性，兩者聯(lián)合檢測(cè)可以提高肝癌的診斷率。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血漿TRX水平與性別、年齡、腫瘤大小、肝炎病毒感染情況、腫瘤組織分化程度及TNM分期等無(wú)關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明血漿TRX蛋白可成為診斷肝癌的新的輔助腫瘤標(biāo)志物，TRX蛋白和AFP聯(lián)合檢測(cè)能提高肝癌的早期診斷率，然而同時(shí)也需要大規(guī)模的臨床試驗(yàn)證明此結(jié)論。

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