陳海炎 黃萬(wàn)旭 羅 琛

(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

鯽Kaiso基因cDNA的克隆和表達(dá)分析

陳海炎 黃萬(wàn)旭 羅 琛

(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

在爪蟾和斑馬魚(yú)中, Kaiso是一種在整個(gè)基因組范圍內(nèi)與甲基化CpG序列特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制因子,在調(diào)控被甲基化基因表達(dá)的時(shí)間模式中起重要的作用。為深入研究DNA甲基化對(duì)我國(guó)重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)生殖和發(fā)育的影響, 我們克隆了鯽Kaiso基因的cDNA序列, 并對(duì)其時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了分析。該cDNA全長(zhǎng)3145 bp, 5′-非翻譯區(qū)132 bp, 3′-非翻譯區(qū)1117 bp, 開(kāi)放閱讀框1896 bp, 編碼631個(gè)氨基酸。鯽Kaiso蛋白與其他物種Kaiso蛋白的同源性分析表明, 與其他物種一樣, 其 N端和C端分別有高保守性的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域。整胚原位雜交結(jié)果顯示, Kaiso mRNA在早期胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均廣泛表達(dá), 信號(hào)均一, 但從尾芽期開(kāi)始出現(xiàn)組織特異性表達(dá)差異。對(duì)不同發(fā)育階段胚胎的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明: 卵子中有高豐度的母源Kaiso mRNA存在; 在卵裂期至囊胚中期胚胎中Kaiso mRNA的豐度逐漸降低; 從囊胚中期至原腸早期都維持在最低水平狀態(tài); 原腸后期其表達(dá)水平又逐漸升高, 至尾芽期達(dá)到與未受精卵中相當(dāng)?shù)母咚胶笤谄鞴侔l(fā)生期的整體水平又稍有下降。Kaiso mRNA豐度在胚胎發(fā)育早期的這種變化過(guò)程提示在卵裂期檢測(cè)到的mRNA可能都是母源mRNA, 合子核Kaiso基因可能是在囊胚晚期后才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。對(duì)成體不同組織的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明Kaiso的表達(dá)存在明顯的組織特異性差異, 在鯽肌肉、視網(wǎng)膜、心臟和腦中表達(dá)水平較高, 而在腎、胰、肝等器官中表達(dá)水平很低。Kaiso表達(dá)的時(shí)間和組織特異性提示其作為甲基化基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子參與了胚胎和成體基因表達(dá)時(shí)空模式的調(diào)控。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究Kaiso和DNA甲基化修飾在鯽發(fā)育調(diào)控和遺傳育種中的作用提供了基礎(chǔ)資料。

鯽; Kaiso; 基因克隆; 表達(dá)時(shí)空模式

在脊椎動(dòng)物中, DNA甲基化修飾與細(xì)胞的分化和發(fā)育[1,2], 基因的表達(dá)調(diào)節(jié)[3], 親本印記[4], 染色質(zhì)的穩(wěn)定和X染色體失活[5]都有關(guān), 并在沉默內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒, 免疫系統(tǒng)發(fā)育調(diào)節(jié)[6]和抑制同源重組[7]中發(fā)揮重要作用。通常認(rèn)為, DNA甲基化是通過(guò)與甲基化的CpG二核苷酸特異結(jié)合蛋白的結(jié)合使特定位點(diǎn)染色質(zhì)失活, 而抑制被甲基化基因的轉(zhuǎn)錄[8—10], 目前發(fā)現(xiàn)的這類(lèi)蛋白主要有MeCP2、MBD1、MBD2、MBD4及Kaiso[11]。

Kaiso是BTB/POZ鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族的一員[12]。Kaiso最先是通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn), 用一種粘連蛋白p120-catenin作為誘餌將其篩選到的[13]。 Ruzov, et al.的研究證明了Kaiso是一種在整個(gè)基因組范圍內(nèi)與甲基化CpG序列特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制因子[14]。在爪蟾(Xenopus laevis)和斑馬魚(yú)(Danio rerio)中, Kaiso蛋白功能的缺失, 可以導(dǎo)致一些合子基因在囊胚中期轉(zhuǎn)換之前提前表達(dá), 出現(xiàn)部分細(xì)胞凋亡, 胚孔關(guān)閉延遲, 腦室和背軸結(jié)構(gòu)發(fā)育嚴(yán)重畸形[14,15]。最近的研究證明魚(yú)類(lèi)Kaiso蛋白是抑制甲基化的母源no tail基因拷貝表達(dá)所必需的[16], 在維持雙親特異性甲基化基因的不對(duì)稱表達(dá)中起重要作用。這些研究結(jié)果說(shuō)明在魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)動(dòng)物中, Kaiso在胚胎發(fā)育早期抑制被甲基化基因的表達(dá)和保障胚胎按正確的時(shí)空模式發(fā)育起重要的作用。

鯽(Carassius auratus)是我國(guó)廣泛養(yǎng)殖的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)和觀賞魚(yú)類(lèi), 并具有多種不同倍性和生殖方式的亞種, 是研究魚(yú)類(lèi)生殖控制和基因組進(jìn)化的獨(dú)特材料[17,18]。為開(kāi)展DNA甲基化對(duì)重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制的研究,我們克隆了兩性生殖鯽的Kaiso全長(zhǎng)cDNA序列,并通過(guò)整胚原位雜交和實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)其表達(dá)的時(shí)空模式進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用鯽為兩性生殖的二倍體鯽 (Carassius auratus)。雌、雄鯽均于繁殖季節(jié)購(gòu)自杭州市魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖場(chǎng)。雌、雄親本在本實(shí)驗(yàn)室水族箱中分別養(yǎng)殖。交配前10h將雌、雄鯽魚(yú)注射HCG(絨促性素, Human chorionic gonadotrophin, HCG; 寧波第二激素廠)進(jìn)行人工催產(chǎn)后放入同一水族箱中。激素劑量為雌魚(yú)每1 kg體重2000單位, 雄魚(yú)劑量減半。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵后擠取精子和卵子進(jìn)行人工授精。胚胎置于(22±1)℃的環(huán)境發(fā)育。選取不同時(shí)期胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肌肉、大腦、心臟、腎臟、胰臟、視網(wǎng)膜、肝臟等各成體組織均直接取自活體鯽魚(yú)。

1.2 總RNA的抽提和cDNA第一鏈的獲得

使用總RNA抽提試劑盒RNAgents Total RNA Isolation System (Promega)提取鯽胚胎不同發(fā)育時(shí)期及各成體組織的總RNA。抽提后的總RNA溶于無(wú)核酸酶水中置于?80℃冰箱中備用。以提取的總RNA為模板, 使用ClonTech公司的SMARTer?RACE cDNA Amplification的試劑盒分別合成5′RACE和3′RACE相應(yīng)的cDNA文庫(kù)。具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 鯽全長(zhǎng)Kaiso mRNA的克隆

使用ClonTech公司的SMARTer? RACE cDNA Amplification試劑盒。該試劑盒通過(guò)提供特定接頭,無(wú)需進(jìn)行傳統(tǒng)的“去帽子”反應(yīng), 結(jié)合所設(shè)計(jì)的RACE特異性引物, 可以方便地對(duì)已知序列的5′端和3′端進(jìn)行擴(kuò)增。

通過(guò)比對(duì)已知的斑馬魚(yú)和爪蟾Kaiso基因序列,得到其相對(duì)保守的序列, 然后根據(jù)保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)并在上海生工合成了擴(kuò)增鯽5′末端的一對(duì)引物: GK-5′-GSP: 5′CTTGTTGCAGTAATGGCACGGA3′(位置見(jiàn)圖1)。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5′RACE擴(kuò)增, 擴(kuò)增得到的序列送去上海生工測(cè)序, 測(cè)序后的結(jié)果經(jīng)NCBI中的BLAST功能分析, 證明其為斑馬魚(yú)和爪蟾Kaiso的同源片段, 因此可確定此片段為鯽Kaiso mRNA 5′末端的序列。據(jù)5′RACE得到的序列, 設(shè)計(jì)并在上海生工合成了3′RACE特異性引物: GK-3′-GSP: 5′AGCAGTAACGGACCAACCAACG3′(位置見(jiàn)圖1)。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增, 擴(kuò)增得到的序列送去上海生工測(cè)序。 序列分析確定其為斑馬魚(yú)和爪蟾Kaiso3′端的同源片段后, 對(duì)所得的Kaiso mRNA的5′和3′片段進(jìn)行拼接得到完整的金魚(yú)Kaiso mRNA序列(圖1)。

1.4 整胚原位雜交

根據(jù)1.3中所得到的鯽Kaiso mRNA序列, 設(shè)計(jì)并在上海生工合成了擴(kuò)增鯽Kaiso 原位雜交探針的引物: Kaiso (+): 5′GCCATCGATATGTCGAAACTA AAGCTAATATCTGC3′; Kaiso (-): 5′ACCGAATTCT CAGTACGTCTCTGGTATAACAAAC3′。將擴(kuò)出的序列克隆至pCS107 vector中, 用ClaI(Takara)酶切處理, 使重組質(zhì)粒線性化, 以它為模板, 用T7 RNA聚合酶(Roche)和含有地高辛標(biāo)記UTP的NTP(Promega)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到鯽Kaiso的反義RNA探針。整胚原位雜交的胚胎的固定和預(yù)處理、復(fù)水和探針的雜交、非特異性探針的洗脫、抗體的孵育以及顯色等步驟和方法均按文獻(xiàn)[19]所述進(jìn)行。

1.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

圖1 克隆全長(zhǎng)鯽Kaiso mRNA引物的位置示意圖(GSP: 特異性引物; UPM: 通用引物)Fig. 1 Primer positions for cloning the full length of Kaiso mRNA (GSP: Gene-Specific Primer; UPM: Universal Primer A Mix)

運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)鯽胚胎發(fā)育不同時(shí)期及成體各組織中的轉(zhuǎn)錄水平。據(jù)1.3中克隆到的鯽Kaiso mRNA序列, 設(shè)計(jì)并在上海生工合成了實(shí)時(shí)定量PCR引物:GKaiso-RT(+): 5′TCAGGC TTTGGGAGTGACATT3′和GKaiso-RT(-): 5′CTTTG GAAAGGCCCGGTAAT3′。據(jù)鯽β-actin基因cDNA序列(GenBank 序列號(hào): AB039726)設(shè)計(jì)并在上海生工合成了作為內(nèi)參的實(shí)時(shí)定量引物: β-actin (+): 5′TCCCTTGCTCCTTCCACCA3′; β-actin (-): 5′GGAA GGGCCAGACTCATCGTA3′。用1.2中提取的總RNA為模板, 使用PrimeScript RT reagent Kit (Takara)合成mRNA第一條鏈, 具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 在此過(guò)程中使用無(wú)RNA酶的DNA酶消化可能存在于總RNA中的DNA干擾。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的體系為: 0.2 μL 2 mmol/μL的引物、1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、2.5 μL 2×SYBR Premix ExTaq(Takara)、1.1 μL滅菌水。反應(yīng)條件為: 95℃, 10s; 95℃, 5s, 60℃, 20s, 40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR的反應(yīng)及信息收集均在LightCycler 480 System(Roche)上進(jìn)行。程序運(yùn)行完成后進(jìn)行溶解曲線分析以確定PCR產(chǎn)物是否專(zhuān)一,對(duì)每一樣品分析重復(fù)三次以保證結(jié)果的可靠性。并使用β-actin作內(nèi)參對(duì)照, 保證所有樣品中RNA的量一致。目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量按Livak和Schmittgen的方法計(jì)算[20]。據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct值(熒光信號(hào)達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))計(jì)算出目標(biāo)基因Kaiso和對(duì)照基因β-actin Ct值的差異ΔCt; 然后以差異最大的樣本作為參照樣本, 計(jì)算出不同樣品相對(duì)于參照樣本基因的表達(dá)倍數(shù)2?ΔΔCt, 進(jìn)而制作出相對(duì)定量圖表。

2 結(jié)果

2.1 鯽Kaiso mRNA的克隆及序列分析

使用5′RACE和3′RACE技術(shù), 得到鯽Kaiso全長(zhǎng)mRNA的序列。鯽Kaiso mRNA全長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度為3145 bp, 其中5′非編碼區(qū)(5′-UTR)132 bp, 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)1117 bp, 開(kāi)放閱讀框(ORF)1896 bp, 編碼631個(gè)氨基酸。序列已提交至GenBank (序列號(hào): HM045515.1)。

2.2 鯽Kaiso蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及進(jìn)化關(guān)系分析

使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Find Conserved Domains 功能, 并據(jù)推測(cè)的鯽Kaiso蛋白氨基酸序列(圖2a), 將這一推測(cè)的氨基酸序列與斑馬魚(yú)、爪蟾、雞(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的Kaiso蛋白氨基酸序列進(jìn)行相似性比較, 參照它們的蛋白結(jié)構(gòu), 預(yù)測(cè)得鯽Kaiso的蛋白結(jié)構(gòu)(圖2b)。鯽Kaiso蛋白也包括N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端的三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF1、ZF2、ZF3)(圖2b)。

圖2 推譯的鯽Kaiso蛋白質(zhì)氨基酸序列及結(jié)構(gòu)域示意圖Fig. 2 The putative amino acid sequence and the diagram of the putative conserved domains of Carassius auratus Kaiso protein

使用Jellyfish軟件和NCBI (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/)中的BLAST, 將推譯出的鯽Kaiso蛋白氨基酸序列與其他物種Kaiso蛋白氨基酸序列進(jìn)行了同源性分析。結(jié)果表明鯽與斑馬魚(yú)、爪蟾、雞、小鼠、人Kaiso蛋白氨基酸序列相似性分別為77%、41%、41%、42%、40.5% , 但它們N端BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端前兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF1、ZF2)的相似性程度很高(表1)。據(jù)這幾個(gè)物種的氨基酸序列, 用MEGA5.05軟件Phylogeny程序中的Construct/Test Neighbor Joining Tree (s)方式構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3), 表明鯽首先與斑馬魚(yú)類(lèi)聚, 再與爪蟾類(lèi)聚, 再與雞類(lèi)聚, 最后與小鼠、人類(lèi)聚。

表1 鯽與其他幾種脊椎動(dòng)物Kaiso蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域(BTB/POZ、ZF1、ZF2、ZF3)氨基酸序列的同源性比較Tab. 1 Percent identity of amino acid sequence of Kaiso conserved domains (BTB/POZ, ZF1, ZF2 and ZF3) between goldfish and several other vertebrates

2.3 鯽Kaiso在胚胎發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)模式和表達(dá)水平差異

為研究Kaiso在鯽早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)模式, 以體外轉(zhuǎn)錄并用地高辛標(biāo)記的Kaiso RNA 片段為探針, 對(duì)鯽不同發(fā)育時(shí)期的胚胎進(jìn)行了整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)。鯽不同時(shí)期胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)表明: Kaiso在早期胚胎發(fā)育階段廣泛表達(dá), 信號(hào)均一, 但從尾芽期開(kāi)始在胚胎前端的頭部區(qū)域信號(hào)比胚胎后端區(qū)域顯著增強(qiáng)(圖4)。用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)未受精卵, 及不同發(fā)育時(shí)期胚胎進(jìn)行Kaiso mRNA表達(dá)水平的相對(duì)定量分析結(jié)果顯示, 卵子中存在高豐度的母源Kaiso mRNA, 在卵裂期及囊胚中期胚胎細(xì)胞中Kaiso mRNA的豐度逐漸降低, 從囊胚中期至原腸早期都維持在最低水平狀態(tài), 原腸后期其表達(dá)水平又逐漸升高, 至尾芽期達(dá)到與未受精卵中相當(dāng)?shù)母咚? 在器官發(fā)生期的整體水平又稍有下降但維持在較高水平(圖5a)。

圖3 根據(jù)鯽、斑馬魚(yú)、爪蟾、雞、小鼠、人的Kaiso蛋白質(zhì)氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of Kaiso amino acid sequences

2.4 鯽Kaiso在不同成體組織的表達(dá)分析

圖4 鯽早期胚胎不同發(fā)育時(shí)期Kaiso的原位雜交圖Fig. 4 In situ hybridization of Carassius auratus embryos

對(duì)成體不同組織的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明Kaiso在鯽肌肉、腦、心臟、腎臟、胰臟、視網(wǎng)膜、肝臟等成體組織中均有表達(dá), 但在鯽成體不同組織中的表達(dá)水平存在明顯差異。在肌肉、視網(wǎng)膜、心臟和腦中表達(dá)水平較高, 而在腎、胰、肝等器官中表達(dá)水平較低(圖5b)。

3 討論

3.1 鯽Kaiso蛋白的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)氨基酸序列的保守性分析表明, 鯽Kaiso蛋白和其他已知的幾種脊椎動(dòng)物Kaiso蛋白一樣, 在N端有保守的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域, C端有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。對(duì)不同物種Kaiso蛋白的比較分析表明, 從哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲類(lèi)到最低等的脊椎動(dòng)物魚(yú)類(lèi), 其 N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端的前兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是高度保守的, C端最后一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域則變異比較大(表1)。功能分析表明, Kaiso蛋白是通過(guò)其N(xiāo)端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域自二聚化[13], 或與其他蛋白如ZNF131發(fā)生異二聚化[21]而行使阻抑轉(zhuǎn)錄的作用。Kaiso與DNA的結(jié)合則主要通過(guò)其C端的鋅指結(jié)構(gòu)域, 但其第三個(gè)變異較大的鋅指結(jié)構(gòu)域并不是與甲基化的DNA結(jié)合所必需的, 其前兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域就能充分介導(dǎo)與甲基化DNA的特異結(jié)合[15]。Kaiso N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端前兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的高度保守性提示Kaiso蛋白與甲基化DNA特異結(jié)合后, 形成同二聚或者異二聚轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體而抑制甲基化基因轉(zhuǎn)錄的特性對(duì)物種的生存至關(guān)重要。

3.2 鯽Kaiso表達(dá)的時(shí)空模式與發(fā)育調(diào)控的關(guān)系

在兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中, Kaiso是一種與DNA上甲基化的CpG二核苷酸特異結(jié)合從而抑制被甲基化基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄抑制因子, 在抑制這些合子基因在胚胎囊胚中期轉(zhuǎn)換之前表達(dá)中起關(guān)鍵作用, 而其與非甲基化DNA結(jié)合的功能不是魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)胚胎早期發(fā)育所需要的[14,15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鯽卵子中儲(chǔ)存有大量母源Kaiso mRNA, 從卵裂期到囊胚中期其豐度逐漸下降, 從囊胚中期至原腸期維持在最低水平, 從原腸后期又開(kāi)始升高, 至尾芽期達(dá)到最高水平。Kaiso mRNA豐度的在胚胎發(fā)育早期的這種變化過(guò)程提示在卵裂期檢測(cè)到的mRNA可能都是母源mRNA, 合子核Kaiso基因可能是在囊胚晚期后才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。

已有的研究證明在魚(yú)類(lèi)胚胎的早期發(fā)育過(guò)程中存在基因組DNA的去甲基化和再甲基化的重編程過(guò)程[22,33]。這一過(guò)程導(dǎo)致胚胎基因組DNA的甲基化水平在卵裂早期高, 去甲基化后水平降低, 再甲基化后水平又升高的變化過(guò)程。Kaiso mRNA表達(dá)水平變化也與斑馬魚(yú)中基因組DNA去甲基化和再甲基化的重編程所導(dǎo)致的基因組甲基化水平的變化一致, 但與參與甲基化重編程的鯽甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1的情況正好相反[24]。這一結(jié)果提示Kaiso在鯽的整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中可能具有廣泛的抑制甲基化基因表達(dá)的功能, 是調(diào)控這些基因按正確的時(shí)間模式表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一。

原位雜交結(jié)果顯示, 在鯽胚胎發(fā)育的過(guò)程中, Kaiso在胚胎早期發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均廣泛表達(dá), 且信號(hào)均一, 但從尾芽期開(kāi)始在頭部區(qū)域的表達(dá)顯著強(qiáng)于在后端區(qū)域的表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明在器官發(fā)生階段Kaiso的表達(dá)出現(xiàn)了組織特異性。成體不同組織中Kaiso的表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量PCR分析進(jìn)一步證明了這種Kaiso表達(dá)的組織特異性: 在細(xì)胞分裂增殖活動(dòng)較弱的肌肉、視網(wǎng)膜、心臟和腦等組織中的表達(dá)水平較高, 而在細(xì)胞分裂增殖旺盛的腎、胰、肝等器官中表達(dá)水平較低。鯽Kaiso基因的這種組織特異性表達(dá)式樣提示其作為甲基化基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子, 通過(guò)調(diào)控這些基因按正確的空間模式表達(dá)而參與了不同組織和器官功能的調(diào)控。

圖5 鯽Kaiso基因的實(shí)時(shí)定量PCRFig. 5 Real-Time PCR detection of Carassius auratus Kaiso gene

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF KAISO IN GOLDFISH, CARASSIUS AURATUS

CHEN Hai-Yan, HUANG Wan-Xu and LUO Chen
(Collage of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Previous studies have demonstrated that Kaiso, a methyl-CpG specific binding protein and a global transcriptional repressor, plays an important role in timing the expression of methylated genes during early embryogenesis in amphibian and zebrafish. To investigate the reproductive and developmental functions of DNA methylation in goldfish (Carassius auratus), an important cultural fish, we cloned its full-length Kaiso cDNA by reverse transcription and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The spatiotemporal expression pattern of goldfish Kaiso was examined by whole mount in situ hybridization and real-time quantitative reverse-transcriptional polymerase chain reaction (qRT-PCR). The entire Kaiso cDNA was 3145 bp long, including a 132 bp long 5′-UTR, a 1117 bp long 3′-UTR and a 1896 bp long open read frame, which encoded a protein with 631 amino acids. Amino acid sequence alignment of Kaisos of Carassius auratus, Danio rerio, Xenopus laevis, Gallus gallus, Mus musculus and Homo sapiens revealed that the structure of goldfish Kaiso protein also consisted a highly-conserved BTB/POZ domain at the N-terminal and zinc finger domains at the C-terminal. Whole-mount in situ hybridization examination showed that Kaiso was ubiquitously expressed during early embryogenesis but tissue-specifically expressed from bud stage onward. qRT-PCR examination revealed that high abundance maternal Kaiso mRNA existed in the eggs. During embryogenesis, the level of Kaiso mRNA gradually decreased during cleavage and remained low from late blastula stage to early gastrula stage, and then gradually increased from late gastrula stage and reached to the highest level at bud stage. These results suggested that the Kaiso transcripts detected in cleavage stage might be the maternal mRNA and the transcription of zygotic Kaiso might start at late blastula stage. qRT-PCR analysis of different adult tissues revealed that the transcriptional levels of Kaiso in the muscle, retina, heart and brain were much higher than those in the kidney, pancreas and liver. The spatiotemporal expression pattern of Kaiso suggested that Kaiso as a methyl-CpG specific binding protein and a global transcriptional repressor was involved in regulating the spatiotemporal pattern of gene expression both in the embryo and in the adult. These results provided useful information for studying of the roles of Kaiso and DNA methylation in goldfish reproduction and embryogenesis.

Goldfish; Kaiso; Gene cloning; Spatiotemporal expression pattern

Q781

A

1000-3207(2013)01-0001-07

10.7541/2013.1

2011-11-17;

2012-11-04

國(guó)家973項(xiàng)目(2010CB126301)資助

陳海炎(1984—), 女, 湖北隨州人; 碩士; 主要從事發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail: chenhaiyan000630@gmail.com

羅琛, E-mail: luoc@zju.edu.cn